蛋白质的修饰和表达课件.ppt

第三章第三章 蛋白蛋白质质的修的修饰饰和表达和表达 蛋白蛋白蛋白蛋白质质质质的修的修的修的修饰饰饰饰和表达是蛋白和表达是蛋白和表达是蛋白和表达是蛋白质质质质工程的重要工程的重要工程的重要工程的重要研究内容和手段将从蛋白研究内容和手段将从蛋白研究内容和手段将从蛋白研究内容和手段将从蛋白质质质质修修修修饰饰饰饰的化学的化学的化学的化学途径、蛋白途径、蛋白途径、蛋白途径、蛋白质质质质改造的分子生物学途径和重改造的分子生物学途径和重改造的分子生物学途径和重改造的分子生物学途径和重组组组组蛋白蛋白蛋白蛋白质质质质的表达的表达的表达的表达进进进进行行行行讲讲讲讲解实用文档第一第一节节 蛋白蛋白质质修修饰饰的化学途径的化学途径蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改变的过程有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学活性，这些修饰称为非必需部分的修饰但多数情况下，蛋白质结构的改变将导致生物活性的改变实用文档n n影响化学修饰的主要因素有两方面：n n1、蛋白质功能基的活性反应，包括基团之间的氢键和静电作用等，基团之间的的空间阻力n n2、修饰剂的反应活性。

实用文档一、蛋白一、蛋白质侧链质侧链的化学修的化学修饰饰n n在在2020种天然氨基酸的种天然氨基酸的侧链侧链中，大中，大约约有一半可以在足有一半可以在足够够温和温和的条件下的条件下产产生化学取代而不使生化学取代而不使肽键肽键受受损损，其中氨基、，其中氨基、巯巯基基和和羧羧基特基特别别容易容易产产生有用的取代生有用的取代n n因因为为任何任何给给定的氨基酸残基在蛋白定的氨基酸残基在蛋白质质分子中可能出分子中可能出现现不止不止一次，如果用化学的方法一次，如果用化学的方法对对氨基酸氨基酸进进行修行修饰时饰时，正常情况，正常情况下所有相关的氨基酸下所有相关的氨基酸侧链侧链都要被取代至于都要被取代至于谈谈到氨基和到氨基和羧羧基基基基团团，尽管，尽管处处在在侧链侧链上和末端基上和末端基团团的的pKpK值值有差有差别别，但在，但在化学上很化学上很难难将将肽链肽链的的 - -氨基或氨基或 - -羧羧基基基基团团与与侧链侧链上的氨基上的氨基或或羧羧基相区基相区别别实用文档n n蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的实用文档n n（一）巯基的化学修饰n n由于巯基有很强的亲核性，巯基基团一般是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。

n n烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和碘乙酰胺氨基酸测序前，常用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化，以防止半胱氨酸的降解n n其他一些卤代酸、卤代酰胺也可以修饰巯基n nN-乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修饰试剂，该反应具有较强的专一性并伴随光吸收的变化实用文档n n5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反应程度实用文档n n（二）氨基的化学修饰n n赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比较容易与修饰剂发生作用的位点n n常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等实用文档n n（三）羧基的化学修饰n n谷氨酸、天冬氨酸n n修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺类实用文档n n（四）二硫键的化学修饰n n一般用变性剂如巯基乙醇，将二硫键还原成游离的巯基，再通过巯基修饰的方法对其进行修饰，如经过羧甲基化处理，以防止重新氧化成二硫键。

实用文档n n（五）其他侧链基团的修饰n n1、组氨酸残基的咪唑基可以通过氮原子的烷基化或碳原子的亲核取代来进行修饰实用文档n n2、酪氨酸残基的修饰既可以是酚羟基的修饰，也可以是芳香环上的取代反应实用文档n n3、精氨酸残基含一个胍基，精氨酸残基的强碱性，使其很难与大多数试剂发生修饰反应，但可以和二羰基化合物发生反应实用文档n n4、色氨酸吲哚基可以发生取代反应或者被氧化裂解N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以使吲哚基团氧化成羟吲哚衍生物，但专一性较差，酪氨酸残基也可与该试剂发生反应实用文档n n5、蛋氨酸主要是由于硫醚的硫原子的亲核性所引起的，一些氧化剂可以使蛋氨酸氧化实用文档二、蛋白二、蛋白质质的位点的位点专专一性修一性修饰饰n n专一性包括两方面的含义：一是试剂对被修饰基团的专一性；二是试剂对蛋白质分子中被修饰部位，如膜蛋白质上的激素结合部位、酶的活性部位等位点的专一性，一般这类试剂不仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专一性这类专一性的化学修饰，称为亲和标记或专一性的不可逆抑制作用这类修饰试剂也被称为位点专一性抑制剂实用文档n n（一）亲和标记n n亲和标记是一类位点专一性的化学修饰，试剂可以专一性标记于酶的活性部位上，使酶不可逆的失活，因此又称为专一性的不可逆抑制作用。

实用文档n n这类抑制剂可分为两类：n n一类是Ks型的不可逆抑制剂，它是根据底物的结构设计的，它具有和底物结构相似的结合集团，同时还具有和活性部位氨基酸残基的侧链基团反应的活性基团实用文档n n另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶催化过程设计的这类抑制剂具有和底物类似的结构，具有被酶催化和结合的性质此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而活化，对活性部位起不可逆抑制作用这类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性底物”实用文档n n（二）光亲和标记n n这类试剂在结构上除了有一般亲和试剂的特点外，还具有一个光反应基团n n反应一般分两步进行：第一步，试剂先与蛋白质的活性部位在暗条件下发生特异性结合；第二步，光照，试剂被光激活后，产生一个高度活泼的功能基团，与活性部位的侧链基团发生反应实用文档三、蛋白三、蛋白质质的聚乙二醇修的聚乙二醇修饰饰n n聚乙二醇（PEG）由环氧乙烷聚合而成，两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到单甲氧基聚乙二醇（mPEG）蛋白质修饰中应用最多的是mPEG的衍生物实用文档n nPEG与蛋白质的非必需基团共价结合时，可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇，避免抗体产生，或者阻止抗原与抗体的结合而抑制免疫反应的发生。

n n还可以保护蛋白质不易被蛋白酶水解n n修饰后，分子量增加，肾小球滤过减少n n这些均有助于蛋白质类药物循环半衰期的延长实用文档n n修饰时，先对PEG进行活化，活化的PEG可与蛋白质分子侧链上的各种化学基团反应而与蛋白质相偶联，蛋白质分子上与PEG进行偶联的基团主要是氨基、巯基和羧基实用文档四、蛋白四、蛋白质质的化学交的化学交联联和化学偶和化学偶联联n n化学交联可以发生于分子内的亚基与亚基之间，也可以发生与蛋白质分子与分子之间，也可以发生于蛋白质分子与分子之间，也可发生于多个分子之间，而形成网状交联交联剂为含有双功能基团的化学试剂如戊二醛n n蛋白质的化学偶联是指将蛋白质分子偶联到一个化学惰性的水不溶性载体上，形成固定化蛋白质实用文档蛋白蛋白质质分子的固定化分子的固定化n n蛋白蛋白质质分子的固定主要是分子的固定主要是酶酶分子的固定分子的固定n n酶酶的固定化，使用固体材料将的固定化，使用固体材料将酶酶束束缚缚或限制于一或限制于一定区域内，定区域内，酶酶仍能仍能进进行其特有的催化反行其特有的催化反应应，并可，并可回收及重复使用的一回收及重复使用的一类类技技术术n n优优点：点：1 1、既能保持、既能保持酶酶的活性又能克服游离的活性又能克服游离酶酶的一的一些不足，提高些不足，提高酶酶分子的分子的稳稳定性。

定性n n2 2、能与、能与产产物分开，有效地控制生物分开，有效地控制生产过产过程程n n3 3、能与、能与产产物分开，可省去物分开，可省去热处热处理使理使酶酶失活的步失活的步骤骤，，简简化生化生产产工工艺艺n n4 4、、酶酶可在生可在生产产中重复利用，提高了中重复利用，提高了酶酶的利用率的利用率实用文档n n酶的固定化可通过吸附法、交联法、包埋法、共价结合法去实现n n1、交联法n n是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，把酶分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶n n常用的交联剂是戊二醛和双重氮联苯胺 -2，2-二磺酸实用文档n n交联法有四种形式：1）酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物2）酶辅助蛋白交联法：酶量有限时，使酶与惰性蛋白共交联的方法3）吸附交联法：先将 酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联4）载体交联法：用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能集团偶联酶蛋白实用文档n n2、共价结合法n n是酶蛋白分子上功能团和固定支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接，以固定酶的方法。

n n常用载体为：天然高分子（纤维素、琼脂糖、淀粉等），合成高聚物（尼龙、多聚氨基酸），无机支持物（多孔玻璃）实用文档n n影响因素：1）要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团n n2）反应必须在温和pH、中度离子强度和低温缓冲液中进行n n3）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其他功能基团副反应尽可能少n n4）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响实用文档第二第二节节 蛋白蛋白质质的分子生物学改造的分子生物学改造n n蛋白质的分子生物学改造主要有基因突变、基因融合和掺入非天然氨基酸等方法实用文档一、基因突一、基因突变变技技术术n n基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法n n根据改造策略的不同可以分为定点突变和定向进化两种，前者属于理性的设计方法，后者属于非理性的设计方法实用文档n n（一）定点突变n n对已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入n n具有突变率高、简单易行、重复性好的特点n n野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发，而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等。

实用文档n n1、重叠延伸PCR技术n n由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来实用文档实用文档n n为提高葡萄糖异构酶的热稳定性，用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点突变，以Pro138替代Gly138，突变性葡萄糖异构酶的热半衰期比野生型涨一倍，最是反应温度提高10-12度实用文档n n2 2、快速定点突、快速定点突变变n n首先准首先准备质备质粒：必粒：必须须是从常是从常规规E.coliE.coli中中经纯经纯化化试剂试剂盒盒(Miniprep)(Miniprep)或者或者氯氯化化铯纯铯纯化抽提的化抽提的质质粒n n然后，然后，设计设计一一对对包含突包含突变变位点的引物（正、反向）位点的引物（正、反向），和模版，和模版质质粒退火后用粒退火后用PfuTurboPfuTurbo聚合聚合酶酶“ “循循环环延伸延伸” ”，，( (所所谓谓的循的循环环延伸是指聚合延伸是指聚合酶酶按照模版延伸引按照模版延伸引物，一圈后回到引物物，一圈后回到引物5’5’端端终终止，再止，再经过经过反复加反复加热热褪火延伸的循褪火延伸的循环环。

) )正反向引物的延伸正反向引物的延伸产产物退火后物退火后配配对对成成为带为带缺刻的开缺刻的开环质环质粒n n再用再用DpnIDpnI酶酶切延伸切延伸产产物，由于原来的模版物，由于原来的模版质质粒来粒来源于常源于常规规大大肠肠杆菌，是杆菌，是经经damdam甲基化修甲基化修饰饰的，的，对对DpnIDpnI敏感而被切碎，而体外合成的敏感而被切碎，而体外合成的带带突突变变序列的序列的质质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转转化中得以成功化中得以成功转转化，即可得到突化，即可得到突变质变质粒的克隆粒的克隆实用文档n n（二）定向（二）定向进进化化n n在在实验实验室中模仿自然室中模仿自然进进化的关化的关键键步步骤骤——突突变变、重、重组组和和筛选筛选，在，在较较短的短的时间时间内完成漫内完成漫长长的自然的自然进进化化过过程，有效的改造蛋白程，有效的改造蛋白质质，使之适于人，使之适于人类类的需要这这种策略只种策略只针对针对特定蛋白特定蛋白质质的特定性的特定性质质，因而，因而被称被称为为定向定向进进化n n需要两需要两项项支撑技支撑技术术，一是，一是产产生大量突生大量突变变体体为进为进一一步步筛选筛选提供丰富的素材；二是有合适的提供丰富的素材；二是有合适的筛选筛选系系统统，，可迅速从突可迅速从突变题库变题库中中筛选筛选到符合目到符合目标标的蛋白的蛋白质质。

实用文档1、制造突、制造突变变体体n n（1）易错PCRn n基本原理是通过改变正常PCR反应体系中某些组分的数量或质量，随机引入错误碱基从而创造序列多样性的DNA序列文库n n关键在于选择适当的突变频率一般目标基因内有1.5-5个碱基发生碱基替换时，诱变结果最理想n n由于一轮易错PCR往往很难获得满意的结果，因此常用连续易错PCR方法实用文档DNA shuffling allows accelerated evolution of genes实用文档2、、筛选筛选n n（1）表型观察选择和筛选n n菌落分泌的蛋白酶可在含酪蛋白的琼脂平板上产生清晰的水解圈n n在高温并有蓝色木聚糖底物存在的条件下，根据菌落周围地物的颜色变化来筛选耐高温的木聚糖酶实用文档n n（2）高通量筛选方法n n噬菌体展示技术、细菌展示技术、酵母菌展示技术、核糖体展示技术、酵母双杂交系统等实用文档n n噬菌体展示技术n n是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术实用文档Phage display method (1)M13 (a filamentous phage containing ss-DNA encased in a proteincoat): contains five coat proteins, two of which aregVIIIp (gene VIII protein) and gIIIp (gene III protein).实用文档Phage display method (2)实用文档Phage display method (2): (contd.)实用文档n n核糖体展示技术和mRNA展示技术在体外无细胞翻译体系中进行，用mRNA的可复制性，使靶基因得到有效富集，不受细胞转化效率的限制。

大大提高了筛选通量实用文档二、基因融合和基因剪接二、基因融合和基因剪接n n基本原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白质或多肽基因，即可实现两个基因的融合表达实用文档1 1．利用基因融合技．利用基因融合技术术表达外源基因的表达外源基因的缘缘由由（（1 1）通）通过过与一特异性蛋白与一特异性蛋白质质或其特意的或其特意的结结构域形成融合蛋构域形成融合蛋白，可使表达白，可使表达产产物得到有效的回收、物得到有效的回收、纯纯化2 2）通）通过过与具有不同功能的蛋白与具有不同功能的蛋白质质融合，融合，产产生新的多功能生新的多功能蛋白3 3）与）与报报告分子的融合蛋白告分子的融合蛋白结结合，合，应应用于蛋白用于蛋白质质定位或定位或转转基因基因动动物4. 4.）避免被蛋白水解）避免被蛋白水解酶酶水解水解（（5 5）改）改变细变细胞溶解性，防止包涵体的形成胞溶解性，防止包涵体的形成（（6 6）定向定位在宿主的不同区位定向定位在宿主的不同区位实用文档2 2．基因融合的策略．基因融合的策略（（1 1）方式）方式A A酶酶切后，直接剪接到适当的信号切后，直接剪接到适当的信号肽肽之后之后B B在目的基因两端分在目的基因两端分别别加上不同的加上不同的亲亲和和标签标签，有利，有利于蛋白于蛋白纯纯化化C C将目将目标标基因插入信号基因插入信号肽肽序列和一插入序列之序列和一插入序列之间间，，成成为为一种可插入到一种可插入到细细胞膜和胞膜和细细胞壁的蛋白胞壁的蛋白编码编码。

实用文档n n（2）融合蛋白接头的设计和选择n n多个不同模块连接成一个大分子时，其中起连接作用的氨基酸链即为linkern n因素：n n长度在10-15个氨基酸之间n n具有一定柔性n n避免产生二级结构n n选择非疏水性的氨基酸，常用序列为（GGGGS）3实用文档n n3、融合蛋白标签n n目的：为了重组蛋白质的纯化，目的蛋白质的监测和定向固定，提高重组蛋白质的产量，增加可溶性和稳定性等n n常用片段：多聚精氨酸、多聚组氨酸、FLAG、c-myc等n n这些蛋白不会与融合蛋白发生干扰实用文档n n4、融合蛋白报告分子n n目的：标定目的基因的表达调控n n应用：启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导、药物的筛选n n特点：1、报告基因应不存在于宿主中或易于和内源性基因相区别2、应当有一个简单、快速、灵敏及经济的分析方法来检测报告分子3、报告分子的分析结果应具有很宽的线性范围，以便于分析启动子活性的幅度变化4、报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物的生理活动实用文档n n5、蛋白质剪接-内含肽n n内含肽：在蛋白质成熟过程中被剪切掉的一段框内融合于前体蛋白的氨基酸序列。

n n表达蛋白连接（内含肽介导的蛋白连接）：通过改变裂解条件以及对内含肽进行适当修饰，可以生物合成C端带有硫酯键或N末端带有半胱氨酸的蛋白质分子两种蛋白质混合以后，硫酯键和半胱氨酸利用自然化学连接的原理进行自发的连接反应，在硫酯键和半胱氨酸之间形成肽键，从而将两种蛋白质连接起来实用文档n n6、tRNA介导的蛋白质工程n n在蛋白质工程中，借助于校正tRNA定点掺入非天然氨基酸可以提供蛋白质的结构信息、改进蛋白质检测与分离的方法，甚至赋予蛋白质某些新的特征n n增添一个非天然氨基酸到遗传密码中需要创建一套新的组分，包括tRNA、密码子和氨酰tRNA合成酶n n迄今为止超过20个非天然氨基酸被掺入到遗传密码中实用文档n n例如，含有酮基的对乙酰苯丙氨酸n n含有这个氨基酸的蛋白质能够选择性的被荧光标记用以跟踪和成像，或是被生物素标记用作灵敏度检出许多试剂都可以通过酮基这个化学手柄选择的结合到目标蛋白上实用文档基因融合的用途基因融合的用途 上述上述这这些基因融合策略，主要是有利于外源些基因融合策略，主要是有利于外源基因的表达、表达基因的表达、表达产产物的分离、物的分离、纯纯化以及化以及细细胞定胞定位。

作位作为为蛋白蛋白质质分子改造可以借用分子改造可以借用这这些策略些策略对对蛋蛋白白质质分子中的特定序列、分子中的特定序列、结结构元件乃至构元件乃至结结构域通构域通过过基因剪接来基因剪接来进进行操作实用文档 第三第三节节 重重组组蛋白蛋白质质的表达的表达n n重组蛋白质在大肠杆菌中的表达n n重组蛋白质在酵母细胞中的表达n n重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达实用文档 一、大一、大肠肠杆菌中表达体系的杆菌中表达体系的优优点点n n大大肠肠杆菌杆菌( (E.coliE.coli) )表达体系是目前表达体系是目前应应用最广的一个外源用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首基因表达体系，是外源基因表达的首选选体系n n利用大利用大肠肠杆菌作杆菌作为为表达体系的表达体系的优优点：点：n n遗传遗传学和生理学背景清楚；学和生理学背景清楚；n n容易培养，特容易培养，特别别是高密度是高密度发发酵；酵；n n外源基因外源基因经经常可以达到高效表达常可以达到高效表达实用文档大大肠肠杆菌表达体系的缺点杆菌表达体系的缺点n n大大肠肠杆菌系杆菌系统统最大的不足之最大的不足之处处是不能是不能进进行典型真核行典型真核细细胞所胞所具有的复具有的复杂杂的翻的翻译译后修后修饰饰，如糖基化、，如糖基化、烷烷基化、磷酸化、基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；而广泛二硫特异性的蛋白水解加工等；而广泛二硫键键的形成以及外源的形成以及外源蛋白蛋白质组质组装成多装成多亚亚基复合体的能力也受到限制。

基复合体的能力也受到限制n n大大肠肠杆菌体系的另一个不足之杆菌体系的另一个不足之处处是外源基因是外源基因产产物在大物在大肠肠杆杆菌菌细细胞内易形成不溶性的包涵体；而当真核基因在大胞内易形成不溶性的包涵体；而当真核基因在大肠肠杆杆菌中表达菌中表达时时，作，作为为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白白质质的的N N末端最后，由于真核末端最后，由于真核mRNAmRNA的的结结构特性以及密构特性以及密码码子使用子使用频频率与大率与大肠肠杆菌本身的差异，当用真核杆菌本身的差异，当用真核mRNAmRNA的的序列直接在大序列直接在大肠肠杆菌杆菌细细胞中表达胞中表达时时，有，有时时不能得到足不能得到足够够的的产产物实用文档大大肠肠杆菌表达体系的杆菌表达体系的应应用用 当外源蛋白当外源蛋白质质的分子量小于的分子量小于70kD,70kD,不存在半不存在半胱氨酸或分子内的二硫胱氨酸或分子内的二硫键键少于少于3 3～～4 4个，以及不需个，以及不需要翻要翻译译后修后修饰饰而能保持其生物活性的蛋白而能保持其生物活性的蛋白质质，大，大多可以利用大多可以利用大肠肠杆菌系杆菌系统统得到得到满满意的意的结结果。

果实用文档1．表达．表达载载体的构建体的构建(1) (1) 复制起始点复制起始点 大部分大部分载载体是基于体是基于pBR322pBR322或或pUCpUC质质粒粒的复制起始点，复制起点主要决定了的复制起始点，复制起点主要决定了细细胞内胞内质质粒的拷粒的拷贝贝数前者可保持每数前者可保持每个个细细胞中胞中20-5020-50个拷个拷贝贝，后者，后者为为150-200150-200个个质质粒实用文档(2)(2)选择性基因 (3)(3)载体上至少含有一个选择性基因，一方面用于对转化体的确定，另一方面在培养过程中保持质粒的稳定性4)(4)一般为抗生素抗性基因或报道基因实用文档(3) 强的、可诱导的启动子n n主要作用是促进转录的有效起始原核细胞的启动子由-10区和-35区两部分组成10区是RNA聚合酶的牢固结合位点，-35区是RNA聚合酶的识别位点实用文档(4) 强的转录终止序列 高效表达的载体应该含有终止子，因为合成的mRNA过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，且易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构实用文档(5) 核糖体结合位点原核微生物的mRNA结合核糖体的序列称为SD序列。

SD序列对翻译效率有影响实用文档n n(6) 合适的多克隆位点n n具有多个单一酶切位点的多克隆位点，便于外源基因插入和筛选实用文档2．与外源基因有效表达的相关因素．与外源基因有效表达的相关因素(1)(1)有效的有效的转录转录起始起始(2)(2)一个合适的高表达外源基因的启一个合适的高表达外源基因的启动动子子应应符符合以下几点：第一，必合以下几点：第一，必须须是是较较强强的启的启动动子，子，表达效率在表达效率在10-30%10-30%第二，由启第二，由启动动子控制子控制的本底的本底转录转录很低第三，启很低第三，启动动子能子能够够有一有一些些简单简单及及经济经济合算的方式合算的方式诱导诱导启启动动3)(3)例如：例如：T7T7启启动动子子实用文档(2)(2)转录终转录终止区止区对对外源基因表达效率的影响外源基因表达效率的影响(3)(3)转录终转录终止有两种机制，一种是依止有两种机制，一种是依赖赖六聚体蛋白六聚体蛋白rhorho的的rhorho依依赖赖性性转录终转录终止，止，rhorho蛋白能使新生蛋白能使新生RNARNA转录转录本从模板脱离另一种是本从模板脱离另一种是rhorho非依非依赖赖性性转录终转录终止，它特异性依止，它特异性依赖赖与模板上与模板上编码编码的信号。

的信号4)(4)贯贯穿启穿启动动子的子的转录转录将抑制启将抑制启动动子的功能，造成子的功能，造成启启动动子的封堵子的封堵实用文档n n（3）mRNA稳定性的影响n nmRNA的快速降解势必影响蛋白质的合成n n通常用非常强的启动子来弥补不稳定的mRNA的转录物实用文档(4)(4)密密码码子偏好性子偏好性遗传遗传密密码码有有6464种，但是种，但是绝绝大多数生物大多数生物倾倾向于利用其向于利用其中一部分那些被最中一部分那些被最频频繁利用的称繁利用的称为为最佳密最佳密码码子，子，不被不被经经常利用的称常利用的称为为稀有或利用率低的密稀有或利用率低的密码码子富含富含E.coliE.coli不常用密不常用密码码子的外源基因有可能在子的外源基因有可能在E.coliE.coli中得不到有效表达精氨酸中得不到有效表达精氨酸tRNAtRNA是多种哺乳是多种哺乳动动物物基因在基因在细细菌中表达的限制因子菌中表达的限制因子实用文档n n5、表达定位n n外源蛋白可能定位于：胞内、胞质膜、胞周质、外膜和胞外培养基n n（1）表达的外源蛋白定位于胞外n n小分子蛋白较易表达，产物接近天然蛋白；但表达大分子时，则易在胞内形成包涵体。

n n蛋白质在细胞质中被降解的可能性比其他的定位要大得多n n从细胞质蛋白混合物中纯化目的蛋白相对比较困难实用文档n n（2）细胞外周质表达n n有利于目的蛋白的纯化；有利于蛋白质的正确折叠；信号肽在细胞内剪切更有可能产生目的蛋白的天然N末端；蛋白质降解也少n n许多原核和真核细胞来源地信号肽已成功用于蛋白质从内膜到外周质的转运如：E.coli的PhoA信号、人生长激素信号肽等实用文档n n（3）细胞外分泌n n易于纯化，减少降解n n方法：a、利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途径，b、利用信号肽序列、融合伴侣和具有穿透能力的因子实用文档（4）外源蛋白表达定位在胞质膜上形成具生物活性的膜蛋白，大肠杆菌内膜上表达定位的G蛋白偶联受体，已用于受体与配基的结合、G蛋白与效应物的偶联、受体自身的结构等实用文档n n（5）表达外源蛋白定位于菌体表面n n定位方式：a、将外源肽插入大肠杆菌外膜蛋白的膜外区，使一些短肽在细菌表面呈现B、将外源蛋白序列插入菌体表面的结构，如鞭毛和菌毛的蛋白中C、以菌体表面脂蛋白或Lpp-OmpA融合体作为靶向载体蛋白，将外源蛋白或肽序列与脂蛋白或Lpp-OmpA的N端或C端序列融合，表达定位于菌体表面。

实用文档n n6、宿主选择对表达的影响n n宿主菌对外源基因的表达会产生一定的影响例如，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株Rosetta 2系列可以补充大肠杆菌缺乏的七种稀有密码子对应的tRNA，提高了外源基因的表达水平Origami 2系列是硫氧化还原蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达实用文档n n7、培养条件的控制对表达效率的影响n n蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统获得提高n n高密度培养系统可以分为：分批培养、补料分批培养和连续培养n n培养基的组分和培养参数会影响蛋白酶的活性、分泌和产量n n培养基的特殊操作能显著提高蛋白质释放到培养基中如培养基中添加甘氨酸能增强外周质蛋白释放到培养基中实用文档n n（三）真核基因在原核细胞中表达及调控n n需注意：1、基因的编码区必须是连续的，因此要用切除内含子的cDNA2、基因必须置于原核细胞的启动子、终止子和SD序列的控制之下，才能被宿主的转录与翻译系统有效识别3、产生的mRNA必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白质折叠。

实用文档二二、、目目标标蛋白蛋白质质在酵母在酵母细细胞中的表达胞中的表达优点：1、既有原核表达系统操作简单、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点2、对外源蛋白的翻译后修饰实用文档n n常用表达系常用表达系统统：甲醇酵母表达系：甲醇酵母表达系统统n n特点：特点：1 1、具有、具有强强有力的乙醇氧化有力的乙醇氧化酶酶基因基因（（AOX1AOX1）启）启动动子，可子，可严严格格调调控外源蛋白的表达控外源蛋白的表达2 2、、对对表达蛋白表达蛋白进进行翻行翻译译后修后修饰饰，从而使其表达的，从而使其表达的蛋白具有生物活性蛋白具有生物活性3 3、表达量高表达量高4 4、表达的蛋、表达的蛋白既可以存在于胞内，也可以存在于胞外酵母白既可以存在于胞内，也可以存在于胞外酵母自身分泌的背景蛋白很少自身分泌的背景蛋白很少5 5、整合有外源基因的、整合有外源基因的重重组组子表达系子表达系统统十分十分稳稳定6 6、糖基化程度低，使、糖基化程度低，使得他的蛋白抗原性得他的蛋白抗原性较较低7 7、、对营对营养要求低，培养养要求低，培养基成分基成分简单简单廉价，可廉价，可进进行高密度高行高密度高产产量的量的发发酵培酵培养，便于工养，便于工业业化生化生产产。

实用文档n n（一）表达菌株n n常用菌株有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等，均为甲醇诱导型，以甲醇为唯一碳源时，宿主菌中AOX1启动子被强烈诱导，是外源蛋白大量表达n n蛋白酶缺陷株，如SMD1168，可以减少分泌蛋白的酶解消化，为外源蛋白的成功表达创造了条件实用文档n n（二）表达载体n n一般用整合型载体作为外源基因的表达载体n n特点：载体与酵母宿主细胞基因组DNA整合，因此稳定性高，但基因的拷贝数量低n n这种载体被设计为穿梭载体，即它可以在大肠杆菌中保存、扩增和构建，线性化后又可转入酵母细胞中实用文档n n1、启动子n nAOX1启动子，仅受甲醇诱导，可产生较高水平的表达，但不适于食品生产，又有火灾隐患n n现发现不以甲醇为唯一诱导物的启动子：GAP、FLD1、DAS、AOX2等n nGAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶基因）的启动子可以利用多种碳源如葡萄糖、甘油等实用文档n n2、选择标记n n一般有两种：n n营养缺陷型选择标记，如His4、Arg4等n n抗性选择标记，G418抗性基因实用文档n n3、信号肽序列n n可以选择外源蛋白自身的信号肽和酵母本身的信号肽。

实用文档n n4、表达载体的转化及与毕赤酵母的整合n n载体首先以质粒的形式转化大肠杆菌并在其内进行扩增，经酶切和测序证明表达载体构建正确后，经DNA内切酶线性化后，转入巴斯得毕赤酵母中进行表达n n整合方式：a、单交换，外源基因通过重组插入到毕赤酵母染色体基因组his4位点或AOX1基因的上游和下游，b、双交换，酵母染色体AOX1基因被载体外源基因表达元件和标记基因所代替，该方法对甲醇的利用率低，但它表达外源基因的效率高实用文档（三）外源基因在（三）外源基因在毕毕赤酵母中的表达赤酵母中的表达n n1、异源蛋白在酵母中表达的一般步骤n nA、将编码异源蛋白的DNA序列克隆进含有酵母启动子和转录终止序列的表达框中n nB、转化及在宿主中稳定维持此DNA融合产物n nC、异源蛋白在特定培养条件下合成n nD、异源蛋白的纯化及其与天然产物的比较实用文档n n2、外源蛋白的表达方式n n分为胞内表达和分泌到胞外两种n n胞内表达适于在胞浆中表达或不含二硫键的非糖基化蛋白n n分泌表达一般为优先原则方式，因为毕赤酵母只分泌很低水平的内源蛋白，外源蛋白的纯化非常简便实用文档n n3、表达产物的翻译后加工、修饰n n毕赤酵母可以对蛋白进行翻译后修饰，包括信号肽加工、蛋白折叠、二硫键形成、O-连接和N-连接糖基化修饰、磷酸化修饰等。

实用文档n n4、影响外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的因素n n（1）目的基因的特性n nA、特定的A+T富含区可作为多腺苷酸或转录终止信号，导致只产生低水平或截短的mRNAn nB、外源序列中的mRNA5’非编码区的核苷酸序列和长度会影响核糖体40S亚单位识别的障碍n nC、某些稀有密码子是制约翻译速率的因素实用文档n n（2）启动子的影响n n常用的强启动子有AOX1、GAP、FLD1n n这些强启动子有时会引起外源蛋白高水平表达，超过宿主细胞翻译后处理加工能力所能承担的最大负荷量，引起蛋白的错误折叠、不加工或错误定位可选择较温和的启动子，如PPEX8、PYPT1实用文档n n（3）基因剂量n n有些单拷贝的表达盒就可得到较理想的表达产量，有些提高拷贝数可大大增加表达水平，还有些增加拷贝数反而降低了表达水平n n因此，高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准，基因剂量与表达水平的关系取决于特定的外源蛋白实用文档n n（4）宿主、整合方式及转化子的类型n nAOX1位点的双交换，可产生表型为Muts （甲醇利用慢）的菌落，单交换引起的基因插入，菌落表型为Mut+一般情况下，胞内表达最好选择Muts ，分泌表达，应尽量选用表型Mut+ 。

但是，对整合位点、整合方式、转化子表型的选择应根据外源基因的特点和研究目的设计合理的技术路线实用文档n n（5）影响蛋白质稳定性的因素n n蛋白酶是一个重要因素n n提高外源目的蛋白稳定性的方法：n n降低培养基的pH和培养温度，破坏蛋白酶作用的最适条件n n培养基中添加蛋白胨和酵母提取物以增加蛋白酶作用的底物n n选用蛋白酶缺陷型菌株做宿主菌进行表达实用文档n n（6）发酵条件的影响n n通气量n n碳源，常用甘油做碳源，但是碳源会抑制AOX启动子一般采用甘油培养基使细胞达到一定浓度，再加甲醇诱导的，两步法来表达外源蛋白n n诱导时间n n起始pHn n添加特殊的营养物质实用文档三、昆虫杆状病毒表达系三、昆虫杆状病毒表达系统统n n核型多角体病毒的多角体蛋白基因是病毒感染晚期高效表达的基因n n1、其缺失对病毒复制增殖毫无影响，可以作为外源基因理想的插入位点n n2、多角体蛋白被外源基因取代后，不形成多角体，在显微镜下可以与野生型相区别实用文档n n（一）杆状病毒表达系（一）杆状病毒表达系统统的原理的原理n n首先建立一个首先建立一个转转移移载载体体质质粒，在粒，在这这个个转转移移载载体上体上含有多角体蛋白基因的启含有多角体蛋白基因的启动动子及多角体蛋白基因子及多角体蛋白基因的旁的旁侧侧序列；然后将外源基因克隆至序列；然后将外源基因克隆至转转移移载载体的体的多接多接头头的合适的合适酶酶切位点切位点处处，使其，使其处处于多角蛋白基于多角蛋白基因启因启动动子的控制之下；再将重子的控制之下；再将重组转组转移移载载体与野生体与野生型病毒型病毒DNADNA一起共一起共转转染昆虫染昆虫细细胞，外源基因通胞，外源基因通过过细细胞内同源重胞内同源重组组而插入病毒基因而插入病毒基因组组中。

最后利用中最后利用空斑形空斑形态态形形态态的差异的差异进进行行筛选筛选、、纯纯化重化重组组病毒，病毒，再以再以纯纯化的重化的重组组病毒感染宿主病毒感染宿主细细胞或幼虫，即可胞或幼虫，即可获获得大量的外源基因表达得大量的外源基因表达产产物实用文档n n（二）杆状病毒表达系统的特点n n1、重组蛋白具有完整的生物学功能 n n2、能进行翻译后的加工修饰n n3、表达水平高n n4、能容纳大分子的插入片段n n5、能同时表达多个基因n n6、适合表达细胞毒性蛋白n n7、安全实用文档n n不足之处：n n1、非连续性表达重组杆状病毒能导致宿主死亡，所以每一轮外源蛋白的表达必须重新感染新鲜的培养细胞或宿主n n2、其表达产物的糖基化相对简单，多不分支，糖侧链甘露糖成分高，缺乏符合寡糖实用文档 三、重三、重组组蛋白蛋白质质在哺乳在哺乳动动物物细细胞中的表达胞中的表达 实用文档1．哺乳．哺乳动动物物细细胞表达体系的胞表达体系的优优点点n n哺乳哺乳动动物物细细胞表达体系的种胞表达体系的种类类和数目已和数目已经发经发展很快n n哺乳哺乳动动物物细细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优优势势。

它具有复它具有复杂杂的翻的翻译译后加工系后加工系统统，糖基化以及二硫，糖基化以及二硫键键在在合成和分泌合成和分泌过过程中自然而然的正确形成哺乳程中自然而然的正确形成哺乳动动物物细细胞具胞具有有产产生正确折叠和完全生物活性的蛋白生正确折叠和完全生物活性的蛋白质质n n实实例：例：组织组织血血纤维纤维蛋白溶蛋白溶酶酶原激活因子原激活因子(tPA)(tPA)、、红细红细胞生成胞生成素素(EPO)(EPO)、人、人DNADNA酶酶在大肠肠杆菌中表达杆菌中表达tPAtPA时时，，产产生生错错折折叠和非糖基化，而在酵母中表达叠和非糖基化，而在酵母中表达tPAtPA产产生生过过糖基化，二者糖基化，二者的的产产物都没有生物活性物都没有生物活性实用文档分泌型哺乳分泌型哺乳动动物物细细胞表达系胞表达系统统 哺乳哺乳动动物物细细胞表达系胞表达系统统可以通可以通过设计过设计，使外源重，使外源重组组蛋蛋白直接分泌到培养基中白直接分泌到培养基中这这个重个重组组表达表达单单位包括位包括N N末端的末端的信号信号肽肽，其作用是起始新生，其作用是起始新生肽链肽链插入到内插入到内质质网中，此信号网中，此信号肽肽在分泌在分泌过过程中被切除，从而程中被切除，从而产产生具正确生具正确N N端的重端的重组组蛋白蛋白质质。

从内从内质质网到高网到高尔尔基体再到基体再到细细胞外空胞外空间间的分泌的分泌过过程程产产生生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶酶水解分泌水解分泌过过程也使蛋白程也使蛋白质质二硫二硫键键正确配正确配对对和正确折叠和正确折叠实用文档哺乳哺乳类动类动物物细细胞表达体系的另一个用胞表达体系的另一个用处处 是在天然是在天然环环境条件下，研究工程化基因境条件下，研究工程化基因产产物的性物的性质质如将胰如将胰岛岛素受体基因素受体基因经经突突变变后，再后，再导导入到特定入到特定细细胞中表达胞中表达发现发现，在受体蛋白，在受体蛋白质质上上单单一氨基酸的突一氨基酸的突变变可可导导致其致其对对胰胰岛岛素素结结合活性的合活性的丧丧失，并失，并导导致激活自磷酸化和酪氨酸激致激活自磷酸化和酪氨酸激酶酶实用文档n n2、表达载体的类型n n分为病毒载体和质粒载体n n病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内常用：腺病毒、逆转录病毒等n n质粒载体是借助于化学方法和物理方法将DNA直接导入细胞中分为整合型和附加体型两类。

实用文档n n3、表达载体的结构元件n n必要元件包括：一个高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的mRNA翻译信号n n视实验需要还可加入标志基因、复制起始点序列、内部核糖体进入位点等实用文档n n4、宿主细胞n n常用的表达重组蛋白的细胞株有CHO细胞、骨髓瘤细胞株、COS细胞、293细胞等n n不同细胞对重组细胞的修饰可能会稍有差别如CHO细胞表达的人白血病抑制因子N端的氨基酸有所缺失实用文档 5．两个主要的哺乳．两个主要的哺乳动动物物细细胞表达系胞表达系统统n n在哺乳在哺乳动动物物细细胞中有三个基因表达系胞中有三个基因表达系统统可供可供选择选择，一是瞬，一是瞬时时表达系表达系统统，二是，二是稳稳定表达系定表达系统统，三是，三是诱导诱导表达系表达系统统n n瞬瞬时时基因表达系基因表达系统统是一个是一个简单简单、有效的外源蛋白表达手段，、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到其表达水平最高可以达到稳稳定定细细胞表达水平蛋白胞表达水平蛋白质质是由是由未整合的、不复制的未整合的、不复制的质质粒粒DNADNA产产生的，生的，这样这样使得蛋白使得蛋白质质表表达的达的时间时间相相对对短，只有短，只有48h48h到到7 7天。

天n n稳稳定表达系定表达系统统需要得到需要得到稳稳定定转转化的化的细细胞株，需要胞株，需要1 1～～2 2个月个月的的时间时间，在，在稳稳定定转转化的化的细细胞中，胞中，DNADNA被整合到染色体中，被整合到染色体中，这这使得重使得重组组蛋白蛋白质产质产物可以一代接一代地物可以一代接一代地产产生n n诱导诱导表达系表达系统统是指目的基因的是指目的基因的转录转录受外源小分子受外源小分子诱导诱导后才后才得以开放得以开放实用文档n n四、体外翻译系统n n又称无细胞蛋白质合成系统，是一种相对细胞内表达系统而言的开放表达系统翻译系统内的组分和翻译条件可以根据需要进行适当的改变n n目前有兔网织血红蛋白系统、麦胚提取物系统、E.coli S30系统实用文档n n兔网织红细胞系统n n由红细胞分化而来，在体内主要负责合成大量血红蛋白以及球蛋白n n优点：本身不带细胞核，但却保留了高效翻译各种核酸信息的能力，可减少背景；合成外源蛋白的效率接近合成外源蛋白质的效率；内源核酸酶少，有助于RNA的稳定；具有一定的翻译后加工活性实用文档n n制备：取新西兰大白兔网织红细胞，通过纯化除去兔网织红细胞以外的污染细胞。

网织红细胞裂解后，提取物用微球菌核酸酶破坏内源mRNA，最大限度降低翻译背景再在兔网织红细胞中加入磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统，以及氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制等实用文档。