分子生物学：生物芯片技术.ppt

生生 物物 芯芯 片技术片技术 基因是什么？基因是什么？DNADNA或蛋白质？或蛋白质？几多试验？几多几多试验？几多论争？论争？是谁将谜底揭破是谁将谜底揭破？？生物芯片技术！主要内容•生物芯片概念•生物芯片类型（基因芯片、蛋白质芯片）•生物芯片应用（基因芯片应用） 人们可能很容易把生物芯片与电子芯片联系起来事实上，两者确有一个最基本的共同点：在微小尺寸基片（1cm2）上集成海量的个体分析单元但它们是完全不同的两种东西，电子芯片上布列的是一个个半导体电子单元，而生物芯片上布列的是一个个生物探针分子 什么是生物芯片？生物探针分子与是生物芯片关系？生物芯片概 念Ø 生物芯片（生物芯片（bio-chipbio-chip）：）：是通过是通过微加工和微电子技术微加工和微电子技术在在硅硅片、尼龙膜等固相支持物上片、尼龙膜等固相支持物上包裹组织、细胞、蛋白质、核酸、包裹组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类等糖类等高密度生物探针分子高密度生物探针分子所构建的所构建的微点阵微点阵，，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、高通量的检测分析由于生物芯片制备过程模拟电子芯片的制备技术，所以又称生物芯片技术。

分类 根据用途分根据用途分类类1.信息芯片：通过将生物探针分子高度集成形成微阵列，以实现对基因、蛋白等生物分子进行高通量的分析与检测包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等2.功能芯片：通过在芯片上完成生命科学研究中样品的分离、扩增、生化反应等功能包括生物样品制备芯片、毛细管电泳芯片等单功能芯片，以及缩微芯片和生物传感器等多功能芯片一般情况下所指的生物芯片主要为生物信息芯片生物芯片特点•主要特点主要特点：–高通量：高通量：提高实验进程，利于显示图谱的快速对照和阅读–集成化、微型化：集成化、微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速度–自动化：自动化：减低成本和保证质量•载体材料载体材料：主要有半导体硅片、玻璃片、聚丙烯膜、硝半导体硅片、玻璃片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜酸纤维素膜、尼龙膜等，其中玻璃片玻璃片最为常用生物芯片技术应用领域生物芯片技术应用领域 基因芯片技术基因芯片技术主要内容•基因芯片发展背景及历程•基因芯片概念、特点和分类•基因芯片工作原理及制备•基因芯片应用、发展前景基因分析芯片开发的动力 -----遗传信息迅猛增长1.人 类 基 因 组 （ 测 序 ） 计 划 （ Human genome project）的逐步实施，现（1997年底）已完成2%序列及800，000个cDNA片段(EST)的测序工作,2005年全部完成；2.其它生物基因组的测定工作：大肠杆菌4.6Mb、酵母13Mb全序列等10余种微生物基因组测序， 模式生物基因组（线虫、果蝇、小鼠）测定。

完成海量基因检测分析工具？？？基因组学的高速发展对核酸序列分析与测定提出新要求•速度快、效率高•高通量，可同时对大量核酸序列进行检测和分析•操作简便、自动化程度高如何研究海量基因在生命过程中所担负的功能，成了全世界生命科学工作者共同的课题！结构性基因组学结构性基因组学大规模测序大规模测序30亿对核苷酸亿对核苷酸3-4万条基因万条基因功能性基因组学功能性基因组学功能研究功能研究3-4万条基因万条基因 基因芯片基因芯片开发基因资源开发基因资源人类疾病的预防、人类疾病的预防、诊断和治疗诊断和治疗基因芯片应运而生基因芯片应运而生 八十年代初，Bains等奖DNA片段固定在支持物上，借助核酸杂交的方法进行基因测序，这就是基因芯片的雏形 1992年 ， Affymetrix公 司 运 用 显 微 光 蚀 刻（photolithography）技术，用原位合成寡核苷酸的方法制备了第一块基因芯片 1995年，Stanford大学Patrick Brown发明了以玻璃为载体，采用显微打印方法的基因微阵列芯片，标志着基因芯片开始进入了广发研究和应用基因芯片的发展经过基因芯片的基本概念基 因 芯 片 (Gene chip) 又 称 DNA芯 片 （ DNA Chip）或DNA微阵列(DNA microarray),它是指将大量特定的DNA探针分子有规律地固定于单面积支持物上形成微阵列，然后与标记样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而对靶基因进行定性和定量分析。

基因芯片的基本构造1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜2.探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是已知的且针对特异基因外观探针支持物剖面图平面局部放大. 集约化、微型化、自动化集约化、微型化、自动化. 高高通量、高灵敏度. 高效、快速、低成本高效、快速、低成本. 样品需要量小样品需要量小•手工测序---4000bp/天•自动测序仪---70万bp/天•生物芯片-----1亿bp/天基因芯片的特点基因芯片的特点基因芯片技术与传统杂交检测方式的比较• 基因芯片的主要类型根据固定支持物的不同可分为：一、固定在聚合物基片(尼龙膜、硝酸纤维素膜)的基因芯片二、固定在玻璃板、硅片等硬质基片上基因芯片原位合成型 指根据预先设计的点阵序列在每个位点通过有机合成的方式直接聚合得到所要求的探针分子该方法有两类：光引导原位聚合技术与压电打印原位合成技术•“点膜”型 合成工作用传统的DNA固相合成仪完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上 从DNA点阵的制备方法来分有两类：主流基因芯片比较 不过，也有人(Robert S. Matson)等以聚丙烯膜为支持物用传统的亚磷酰胺固相法原位合成高密度探针序列。

基因芯片研制的总体蓝图 研制方向的确定基因组序列分析与待检基因探针序列的确定检测样品 的制备探针阵列的准备检测设备的研制杂交检测与数据分析基因芯片制备相关技术硬件：–序列合成设备包括：核酸或多肽合成仪（作预合成点样用）、照相平板印刷及半导体制作相应设备（作光引导原位合成）–激光共聚焦显微扫描设备：激光共聚焦显微镜或相应设备，以采集高密度点阵杂交信号并进行数字化处理分析软件：–基因序列分析及探针筛选技术（可能涉及专利等产权问题）–序列合成及定位技术（光引导原位合成或微量点样技术）–杂交信号的采集和分析技术（需要处理极大量的杂交信号并能由此得到所需信息）基因芯片工作基本原理•原理：核酸分子杂交是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核酸序列分析手段即根据碱基互补配对、变性和复性原理，以大量DNA探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度以及分布进行定性、定量分析得出待测样品的基因序列以及表达信息将大量探针分子固定于支持物将大量探针分子固定于支持物(substrate)(substrate)上，然后与标记的上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。

子的数量 基基 因因 芯芯 片片 工作原工作原 理理基基 因因 芯芯 片技术片技术芯片制备芯片制备样品制备样品制备杂交杂交杂交信号检测杂交信号检测数据分析数据分析概念：根据需要将特异的基因探针通过一定的方式在支持物上打印和固定以构建微阵列，实现高通量分析检测基因 包括：1.探针制备 2.芯片基片的选择 3. 芯片制备方法和固化 一、基因芯片制备探针的制备1.基因克隆与PCR技术：从基因组中制备DNA片段，可兼顾准确性和效率，只适合探针种类不多的小型芯片2.RT-PCR技术：用于制备cDNA探针3.人工合成寡核苷酸片段：虽然可保证准确性，但成本高，速度慢，适合个别样品4.商品化：原位合成:公司制备现成的不同生物的基因芯片，也可定制科学研究和临床检测中常用　　　　薄膜型　如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等这种类型“芯片”的点阵是通过“点膜”形式制作的，并通过一定的方法使探针能够牢固地结合于其上　　玻片型　如玻璃片、半导体硅片这种芯片的点阵是通过原位合成技术制作的，点阵密度很高，所以必须借助于特殊的仪器对测定结果进行解读和分析。

芯片基片以玻璃片最为常用　　芯片基片的选择芯片制备方式•一类是原位合成（即在支持物表面原位合成寡核苷酸探针），适用于寡核苷酸，通过光引导蚀刻技术已有P53、P450， BRCAI/BRCA2 等基因突变的基因芯片–原位光刻合成–压电打印法(Piezoelectric printing)•一类是预合成后直接点样，多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA是将提取或合成好的多肽、蛋白、寡核苷酸、cDNA、基因组DNA等通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上该技术优点在于相对简易低廉，被国内外广泛使用–接触式点样–非接触式点样光引导原位合成和预合成点样技术比较探针固化 在支持物上打印和固定探针后，需要将其固定在支持物表面，同事也要封闭支持物上未打印的区域，以防止核酸样品的非特异性固定，这可通过紫外线交联或者schiff碱链接实现二、样品制备•生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小所以，必须将样品进行提取、扩增•先对检测样品DNA/ mRNA 样本须先PCR扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后再被荧光素或同位素标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。

最后与DNA探针杂交三、杂交及其信号检测1.杂交反应是标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率2.杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关基因表达信息检测仪器a.磷感屏成像系统b.荧光芯片扫描仪四、数据分析•图像分析图像分析：激光扫描仪Scanner得到的Cy3/Cy5图像文件划格，确定杂交范围，过滤背景噪音，提取得到基因表达的荧光信号强度值，最后以列表形式输出•标准标准化处理化处理：由于样本差异、荧光标记效率和检出率的不平衡，需对cy3和cy5的原始提取信号进行均衡和修正才能进一步分析实验数据，标准化正是基于此种目的•Ratio分析分析： Cy3/Cy5的比值，又称R/G值一般0.5-2.0范围内的基因不存在显著表达差异，该范围之外则认为基因的表达出现显著改变•聚聚类分析类分析：实际是一种数据统计分析通过建立各种不同的数学模型，可以得到各种统计分析结果，确定不同基因在表达上的相关性，从而找到未知基因的功能信息或已知基因的未知功能。

基因芯片检测简要过程基因芯片 基本过程总结：–用生物素标记并经扩增（也可使用其它放大技术）的靶序列或样品然后再与芯片上的大量探针进行杂交–用链霉亲和素(streptavidin)偶联的荧光素（常用的荧光素还有lassamine 和phycoerythrin）进行显色–图 象 的 采 集 用 落 射 荧 光 显 微 镜 (epifluorescence microscope)、激光共聚焦显微镜或其它荧光显微装置对片基扫描–由计算机收集荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析基因芯片当前研究状况现在全世界已有十多家公司专门从事基因芯片的研究和开发工作，而且已有较为成型的产品和设备问世这些公司主要以美国的Affymetrix公司为代表，这些公司聚集有多位计算机、数学和分子生物学专家，拥有多项专利产品即将或已有部分投放市场，产生的社会效益和经济效益令人瞩目世界十大基因芯片研制单位简要情况一览续表基 因 芯 片 的 应 用1. 1. 基因表达分析：基因表达分析： 大规模测序大规模测序 发现新基因发现新基因 分析基因表达时空特征分析基因表达时空特征 检测基因差异表达检测基因差异表达2. 2. 基因型、基因突变和多态性分析基因型、基因突变和多态性分析 分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系 人类遗传学研究人类遗传学研究 3. 3. 疾病的诊断与治疗疾病的诊断与治疗 遗传病相关基因的定位遗传病相关基因的定位: :产前筛查与诊断产前筛查与诊断 肿瘤诊断肿瘤诊断 感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断 4. 4. 药物研究中的应用药物研究中的应用 新药开发新药开发 发现药物的新功能发现药物的新功能 调查药物处理细胞后基因的表达情况调查药物处理细胞后基因的表达情况 对药物进行毒性评价对药物进行毒性评价 5. 5. 基因芯片在中医学领域中的应用基因芯片在中医学领域中的应用 药物筛选药物筛选 中医中医“证证”本质的研究本质的研究 针灸原理研究针灸原理研究 6. 环境保护环境保护 快速检测污染微生物和危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。

8. 现代农业现代农业筛选农作物的基因突变和寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相关基因7. 司法司法DNA指纹库对比来鉴定罪犯和亲子鉴定中9. 其它应用其它应用 环境化学毒物的筛选 体质医学的研究 基因芯片产业•探针的合成与固定：使用光导聚合技术每步产率不高（使用光导聚合技术每步产率不高（ 95% ），难于保证好的聚合效果），难于保证好的聚合效果•目标分子与探针杂交：支持物空间阻隔•信号的获取与分析：当前多数方法使用荧光法进行检测和分析，重复性较好，但灵敏仍然不高基因芯片研究方向及当前面临的困难蛋蛋 白白 质质 与与 抗抗 体体 芯芯 片片蛋 白 质 芯 片u原理：原理：与基因芯片相似与基因芯片相似 将如抗原或抗体等蛋白质分子固定在支持物表面，构建蛋白微阵列；通过带分析样品中的生物分子与蛋白芯片发生相互作用 ，然后检测杂交信号进行高通量分析u抗体芯片：抗体芯片：利用阵列上的抗体识别样品中的蛋白或其他分子u蛋白阵列芯片：蛋白阵列芯片：通过阵列上的蛋白检测这些我们感兴趣的蛋白和其他分子蛋白芯片与基因芯片的原理相似不同之处有，一是芯片上固定的分子是蛋白质如抗原或抗体等。

其二，检测的原理是依据蛋白分子、蛋白与核酸、蛋白与其它分子的相互作用蛋白芯片技术出现得较晚，蛋 白 质 芯 片与DNA芯片区别蛋白芯片的应用发发 展展 趋趋 势势u 降低所需费用降低所需费用u 进一步提高自动化进一步提高自动化u 扫描、数据分析等方面：软件开发扫描、数据分析等方面：软件开发u解决难点：解决难点： 蛋白质的纯度；蛋白质的固定蛋白质的纯度；蛋白质的固定本节要点概念：生物芯片，基因芯片，蛋白质芯片简述：基因芯片原理以及特点 基因芯片应用领域识记：生物芯片分类以及特点，基片类型 基因芯片分类。