植物器官培养课件.ppt

植物组织培养学Plant tissue culture                         2017群群  110953973植物器官培养课件植物器官培养课件第四章第四章 植物器官培养植物器官培养第一节第一节 概述概述 第二节第二节 营养器官培养营养器官培养第三节第三节 繁殖器官培养繁殖器官培养 2024/9/142植物器官培养课件植物器官培养课件植物器官培养（植物器官培养（Organ Culture））是指对植物某一器官是指对植物某一器官的全部、部分或器官原基进行离体培养的技术分为的全部、部分或器官原基进行离体培养的技术分为营养器官营养器官（根、茎、叶）和（根、茎、叶）和繁殖器官繁殖器官（胚胎、种子、（胚胎、种子、花器官）培养花器官）培养第一节第一节 概述概述2024/9/143植物器官培养课件植物器官培养课件植植 物物 器器 官官 培培 养养营养器营养器官培养官培养繁殖器繁殖器官培养官培养根培养根培养茎培养（茎培养（ 包括茎尖、茎段）包括茎尖、茎段）叶培养（包括叶原基、叶柄、叶培养（包括叶原基、叶柄、 叶鞘、叶片、子叶）叶鞘、叶片、子叶）花培养花培养 （包括花托、花瓣、花丝、（包括花托、花瓣、花丝、 花柄、子房、花药）花柄、子房、花药）种子培养（包括成熟与未成熟）种子培养（包括成熟与未成熟）胚胎培养（包括幼胚、成熟胚、胚胎培养（包括幼胚、成熟胚、 胚珠、胚珠、 子房、胚乳培养子房、胚乳培养 ））2024/9/144植物器官培养课件植物器官培养课件植物器官培养课件植物器官培养课件 外植体形态发生形成完整植株的途径外植体形态发生形成完整植株的途径（一）外植体（一）外植体- -愈伤组织愈伤组织- -完整植株。

完整植株 具体又可分为三种：具体又可分为三种： 1 1、愈伤组织、愈伤组织- -同时长芽和根同时长芽和根- -植株2 2、愈伤组织、愈伤组织- -茎茎- -根根- -植株3 3、愈伤组织、愈伤组织- -根根- -芽芽- -植株4 4、愈伤组织、愈伤组织- -体细胞胚体细胞胚- -植株植株植物器官培养课件植物器官培养课件第二节第二节 营养器官培养营养器官培养一、离体根的培养一、离体根的培养二、茎尖的培养二、茎尖的培养* *三、茎段的培养三、茎段的培养四、离体叶的培养四、离体叶的培养*2024/9/147植物器官培养课件植物器官培养课件一、离体根的培养一、离体根的培养 （一）（一） 意义：意义： ① ①生理代谢研究的优良实验体系生理代谢研究的优良实验体系 ② ②研究器官分化形态建成的良好体系研究器官分化形态建成的良好体系 ③ ③建立快速生长的根无性系建立快速生长的根无性系 ④ ④进行诱变育种进行诱变育种2024/9/148植物器官培养课件植物器官培养课件1. 1. 培养基选择培养基选择 White培养基；培养基；2/3或或1/2 MS  和和 B5培养基培养基    注：离体根生长要求提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果注：离体根生长要求提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好，加入好，加入VB1、、VB6最重要，生长素对离体根影响不一致。

最重要，生长素对离体根影响不一致培养温度培养温度25－－27℃，暗光培养暗光培养二）（二） 培养方法培养方法2024/9/149植物器官培养课件植物器官培养课件 离体根生长的营养要求n1、无机成分 要求培养基中有全部必要元素，因为它是离体生长所需要的，一般的为MS、B5培养基n2、氮源 氮源有铵态氮、硝态氮和可溶性有机氮如氨基酸或酰胺等，其中以硝态氮的效果最好加入含各种氨基酸的水解酪蛋白，能促进离体根的生长植物器官培养课件植物器官培养课件n3、碳源 以蔗糖的效果最佳，几乎为葡萄糖的10倍蔗糖的浓度为2—3%n4、维生素 维生素以B1和B6最为重要，缺少它根的生长受到阻碍，而加入它可使根的生长成倍的加快B1的使用浓度为0.1-1.0mg/L为宜n5、生长物质 对离体根的生长而言，生长素的效应最为明显，在一般情况，加入适量的生长素能促进根的生长，其反应和需要量因植物种而异：n6、温度和光照 黑暗有利于根的形成，温度一般在16-25℃n7、PH 根发生和生长所需的PH范围一般为5.0-6.0植物器官培养课件植物器官培养课件2. 2. 无性繁殖系的建立无性繁殖系的建立 种种子子消消毒毒 →→ →→ 接接种种→→→→待待根根伸伸长长后后从从根根尖尖一一端端切切取取长长1 1.2cm.2cm的的根根尖尖→→→→接接种种于于培培养养基基→→→→发发育育出出侧侧根根→→→→待待侧侧根根生生长长约约1 1周周后后切切取取侧侧根根的的根根尖尖进进行行扩扩大大培培养养→→→→又又迅迅速速生生长长并并长长出出侧侧根根→→→→切切下下进进行行培培养养，，如如此此反反复复→→→→得得到到从单个根尖衍生而来的离体根的无性系。

从单个根尖衍生而来的离体根的无性系  3. 培养条件培养条件       暗光和温度暗光和温度25-27℃2024/9/1412植物器官培养课件植物器官培养课件4、根的间接增殖n第一步在脱分化培养基上诱导形成愈伤组织，如胡杨的根段培养，可诱导形成白色愈伤组织n第二步在再分化培养基上诱导形成芽的分化，如胡杨从绿色愈伤组织分化出小植株一、离体根的培养一、离体根的培养 植物器官培养课件植物器官培养课件胡萝卜根培养植物器官培养课件植物器官培养课件5、培养方式 离体根的培养方式有三种类型 第一种固体培养法，即将根尖接种在固体培养基上，根依靠培养基中的养分和生长物质而不断生长 第二种是液体培养法，把根尖接种在无琼脂的液体培养基中，经常振荡使根获得充足的氧气 第三种是固体-液体培养法，就是把根基部插入固体琼脂培养基中，根尖浸在液体培养基中，根尖生长而根不断的伸长和分枝 植物器官培养课件植物器官培养课件二、茎尖的培养二、茎尖的培养* *（一）茎尖培养概念及类型（一）茎尖培养概念及类型（二）病毒在植物体内的分布（二）病毒在植物体内的分布（三）茎尖培养方法及步骤（三）茎尖培养方法及步骤2024/9/1416植物器官培养课件植物器官培养课件 ( (一一) )茎尖培养概念及类型茎尖培养概念及类型 茎尖培养茎尖培养：切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行：切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行无菌培养。

无菌培养 茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为：茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为： ①①微茎尖培养微茎尖培养: : 带有带有1-21-2个叶原基的生长点个叶原基的生长点, , 其长度不超其长度不超过过 0.5mm0.5mm 2024/9/1417植物器官培养课件植物器官培养课件 ②②普通茎尖培养：较大的茎尖普通茎尖培养：较大的茎尖( (如几如几mmmm到几十到几十mm)mm)、芽尖及侧、芽尖及侧芽 这里主要讲普通茎尖培养这种培养技术简单，操作方便，这里主要讲普通茎尖培养这种培养技术简单，操作方便，茎尖容易成活，成苗所需时间短茎尖容易成活，成苗所需时间短 茎尖培养的意义：茎尖培养的意义： 普通茎尖培养技术简单，操作方便，易成活，成苗普通茎尖培养技术简单，操作方便，易成活，成苗 时间短，加快繁殖时间短，加快繁殖 微茎尖培养可获得脱毒苗；微茎尖培养可获得脱毒苗；2024/9/1418植物器官培养课件植物器官培养课件植物器官培养课件植物器官培养课件v病毒侵染植株的叶片后，经过一段时间，即向附近的细胞增殖转移转移速度很慢，每小时只有几微米。

当叶片内病毒浓度增大到一定量时，就转移到韧皮部，随后通过维管束转移到其它部分由于病毒转移速度慢，加上茎尖分生组织无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以生长点的病毒数量极少，几乎检测不出茎尖培养时，切取的茎尖越小，带病毒的可能性就越小——茎尖脱毒的基本原理茎尖脱毒的基本原理 ( (二二) )病毒在植物体内的分布病毒在植物体内的分布植物器官培养课件植物器官培养课件（三）茎尖培养方法及步骤（三）茎尖培养方法及步骤取取材材材材料料处处理理及及消消毒毒培培      养养接接　　种种驯驯化化移移栽栽2024/9/1421植物器官培养课件植物器官培养课件①①直接取材：在生长旺盛、枝直接取材：在生长旺盛、枝条健壮、无病的母株上选生条健壮、无病的母株上选生长不久、杂菌污染少的顶梢长不久、杂菌污染少的顶梢（（1 1－－2 2cmcm）（）（取前可喷杀菌取前可喷杀菌药，可顶芽或侧芽）药，可顶芽或侧芽）②②从试管苗获取从试管苗获取1 1、、 取材取材取取1-2㎝顶梢㎝顶梢2024/9/1422植物器官培养课件植物器官培养课件2 2、材料处理及消毒、材料处理及消毒　 将采集到的茎尖切成将采集到的茎尖切成0.5-1.0cm0.5-1.0cm长长→→→→去叶（休眠去叶（休眠芽预先剥除鳞片）芽预先剥除鳞片） →→ →→流水冲洗流水冲洗2-4h 2-4h →→ →→ 7575％的酒％的酒精中处理精中处理30s 30s →→→→稀释稀释2020倍的次氯酸钠中浸倍的次氯酸钠中浸5-8min(5-8min(取取自老枝条上的可适当延长时间）自老枝条上的可适当延长时间）→→→→用无菌水冲洗数次，用无菌水冲洗数次，准备接种。

准备接种　　　　　　　　　　2024/9/1423植物器官培养课件植物器官培养课件 3 3、、接种接种 接种前再剥掉一些叶片，使茎尖接种前再剥掉一些叶片，使茎尖0.5cm 0.5cm →→→→接种接种 要求：随切随接，动作迅速要求：随切随接，动作迅速 亦可将切下茎尖材亦可将切下茎尖材 料在料在1 1－－5% 5% V VC C液中浸一下液中浸一下2024/9/1424植物器官培养课件植物器官培养课件4 4、、培养的方法和程序培养的方法和程序（（1）培养基）培养基    ①① 基本培养基基本培养基  MS、、White、、 B5、、 Heller培养基    ②② 蔗糖作碳源效果好，浓度蔗糖作碳源效果好，浓度2－－3%　　    ③③ 激素（激素（ 2，，4-D，，IAA，， NAA ）和有机添加物有明显影）和有机添加物有明显影响但激素浓度以响但激素浓度以0.1mg/L为宜，不要太高为宜，不要太高2024/9/1425植物器官培养课件植物器官培养课件生长太慢：生长太慢：茎尖不增大茎尖不增大→→变绿变绿→→细胞逐渐老化细胞逐渐老化→→休眠休眠                                                原因原因: 生长素浓度太低；温度过低或过高；生长素浓度太低；温度过低或过高；生长太快：生长太快：茎尖迅速增大茎尖迅速增大→→愈伤组织愈伤组织→→丧失成苗能力丧失成苗能力    原因原因: 生长素浓度过高；光照太弱或温度太高生长素浓度过高；光照太弱或温度太高；；    生长正常：生长正常：茎尖基部稍增大并形成少量愈伤组织，茎尖颜色茎尖基部稍增大并形成少量愈伤组织，茎尖颜色         逐渐变绿，并伸长，叶原基发育成可见的小叶，逐渐变绿，并伸长，叶原基发育成可见的小叶，         进而形成小苗。

进而形成小苗茎尖生长状态茎尖生长状态2024/9/1426植物器官培养课件植物器官培养课件（（2 2）初代培养条件）初代培养条件 每天每天 光照光照16h16h，， 光强度光强度1500-30001x1500-30001x，， 温度温度25±2℃25±2℃ 2024/9/1427植物器官培养课件植物器官培养课件（（3 3）） 继代培养继代培养 茎尖长成的新梢茎尖长成的新梢→→切成小段切成小段→→增殖培养基中增殖培养基中→→ 1个月左右个月左右→→新梢又可切成小段新梢又可切成小段→→再转入新培再转入新培养基养基→→建立和维持了茎尖无性系建立和维持了茎尖无性系 （（即微型扦插）即微型扦插）            继代培养可用继代培养可用MS培养基2024/9/1428植物器官培养课件植物器官培养课件 （（4 4）） 诱导生根诱导生根 采用采用1／／2MS培养基培养基  加入一定的生长素类调节物质，如加入一定的生长素类调节物质，如NAA、、IBA等新梢基部浸入新梢基部浸入50或或100mg/l的的IBA溶液处理溶液处理4-8h，，然后转移到无激素的生根培养基中。

然后转移到无激素的生根培养基中2024/9/1429植物器官培养课件植物器官培养课件(5) (5) 驯化移栽入土驯化移栽入土 在生根培养在生根培养1 1个月左右个月左右→→→→生长健壮而发达的根系生长健壮而发达的根系→→→→炼苗炼苗→→→→移栽移栽 →→ →→管理（温、光、湿、气）管理（温、光、湿、气）2024/9/1430植物器官培养课件植物器官培养课件 指不带芽和带一个以上定芽或不定芽（包括块茎、球茎指不带芽和带一个以上定芽或不定芽（包括块茎、球茎在内）的幼茎切段的无菌培养在内）的幼茎切段的无菌培养 三、茎段培养三、茎段培养2024/9/1431植物器官培养课件植物器官培养课件茎段培养用于快速繁殖的优点茎段培养用于快速繁殖的优点培养技术简单易行，繁殖速度较快，每年可增殖105-1012株苗；加速良种和珍贵植物的繁殖，芽生芽方式增殖的苗木质量好，且无病，性状均一；解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖的问题，且可节省种株；试管苗便于运输和防止种苗带菌传播，有利于国际种质交流；试管苗可用于保存某些难以用种子保存的种质资源植物器官培养课件植物器官培养课件 （一）定义：（一）定义： 离体叶培养指包括叶原基、叶柄、叶离体叶培养指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。

菌培养 它大多经脱分化形成愈伤组织，再它大多经脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织分化出芽和根由愈伤组织分化出芽和根 其中叶片培养是一个典型的代表其中叶片培养是一个典型的代表 四、离体叶的培养四、离体叶的培养* *2024/9/1433植物器官培养课件植物器官培养课件（二）意义：（二）意义： 1.1.是繁殖稀有名贵品种的有效手段；是繁殖稀有名贵品种的有效手段； 2.2.可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题2024/9/1434植物器官培养课件植物器官培养课件（三）叶片的离体培养方法（三）叶片的离体培养方法 发育方式：叶片培养再生成完整植株有两种方式：发育方式：叶片培养再生成完整植株有两种方式： ① ① 是直接诱导形成芽和根是直接诱导形成芽和根→→→→完整植株；完整植株； ② ② 是先诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织分化形成芽和根是先诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织分化形成芽和根→→→→完整植株完整植株 其中，以第二种方式最为常见其中，以第二种方式最为常见。

2024/9/1435植物器官培养课件植物器官培养课件叶片离体培养发育方式（成苗途径）叶片离体培养发育方式（成苗途径）叶原基叶原基叶　鞘叶　鞘叶　片叶　片子　叶子　叶叶　柄叶　柄愈愈伤伤组组织织芽芽和和根根试试管管苗苗 不定芽不定芽2024/9/1436植物器官培养课件植物器官培养课件 1. 1. 材料选择及灭菌材料选择及灭菌 取植物的幼嫩叶片，切割成适当大小（取植物的幼嫩叶片，切割成适当大小（2—3cm2—3cm），），在流水中冲洗干净再用在流水中冲洗干净再用7575％酒精浸泡约％酒精浸泡约10s10s →→ →→饱和漂白粉液中浸饱和漂白粉液中浸3-15min3-15min，或在，或在0.10.1％升汞中浸％升汞中浸3-3-5min 5min →→→→无菌水冲洗数次无菌水冲洗数次→→→→无菌的干滤纸上吸干无菌的干滤纸上吸干水分水分→→→→接种 注：细嫩与成熟叶片消毒时间不同注：细嫩与成熟叶片消毒时间不同2024/9/1437植物器官培养课件植物器官培养课件2.2.接种接种 外植体大小：外植体大小：0.5cm0.5cm2 2 薄片（叶柄、子叶）薄片（叶柄、子叶）上表皮朝上接种培养基。

最好带叶脉，注意极性上表皮朝上接种培养基最好带叶脉，注意极性2024/9/1438植物器官培养课件植物器官培养课件3.3.培养培养 （（1）培养基：）培养基：   MS、、B5、、White 、、N6；；蔗糖蔗糖3%；；    2.4－－D利于愈伤组织形成，利于愈伤组织形成，NAA抑制芽形成，利于根发生，抑制芽形成，利于根发生，KT、、6-BA利于芽形成利于芽形成   愈伤组织诱导：愈伤组织诱导：BA 1-3mg/L,NAA 0.25-1mg/L；；   分化培养：分化培养：CTK 2 mg/L；；   生根培养：生根培养：NAA 0.5－－1.0 mg/L 2024/9/1439植物器官培养课件植物器官培养课件(2)(2)培养过程：培养过程： 培养约培养约2周至周至4周周→→形成愈伤组织形成愈伤组织→→再分化培养基上再分化培养基上（附加（附加6-BA 2mg／／L ）进行分化培养）进行分化培养→→约约10d左右，左右，愈伤组织开始转绿出现绿色芽点愈伤组织开始转绿出现绿色芽点→→发育成无根苗发育成无根苗→→生根培养基（附加生根培养基（附加 NAA0.5-l mg/L ）） →→发育形成完整发育形成完整植株。

植株2024/9/1440植物器官培养课件植物器官培养课件(3)培养条件：培养条件： 温度：温度：25±2℃      光照时间：光照时间：10-12h，，   光照强度：光照强度：1500-3000 Lx 2024/9/1441植物器官培养课件植物器官培养课件 叶的培养比胚，茎尖和茎段培养难度大叶的培养比胚，茎尖和茎段培养难度大 首先要选用易培养成功的叶组织，如幼叶比成熟叶易首先要选用易培养成功的叶组织，如幼叶比成熟叶易培养，子叶比叶片易培养培养，子叶比叶片易培养 其次要添加适当的生长素和细胞分裂素，保证利于叶其次要添加适当的生长素和细胞分裂素，保证利于叶组织的脱分化和再分化组织的脱分化和再分化 2024/9/1442植物器官培养课件植物器官培养课件第三节第三节 生殖器官的培养生殖器官的培养一、花器官的培养一、花器官的培养二、种子的培养二、种子的培养三、胚胎的培养三、胚胎的培养*2024/9/1443植物器官培养课件植物器官培养课件一、花器官的培养一、花器官的培养2024/9/1444植物器官培养课件植物器官培养课件1. 1. 定义：定义： 花器官培养指整个花器及其花器官培养指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药等的丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。

无菌培养 一、花器官的培养（花蕾）一、花器官的培养（花蕾）2024/9/1445植物器官培养课件植物器官培养课件2 2、意义：、意义： 通过离体花芽培养可了解整体植物和内源激素在花芽性通过离体花芽培养可了解整体植物和内源激素在花芽性别决定中所起的作用别决定中所起的作用 可以了解花器各部分对果实和种子发育的作用可以了解花器各部分对果实和种子发育的作用 内、外源激素在果实种子发育过程中的调控作用内、外源激素在果实种子发育过程中的调控作用 生产上也可用于珍贵品种的扩大繁殖生产上也可用于珍贵品种的扩大繁殖2024/9/1446植物器官培养课件植物器官培养课件二、种子培养二、种子培养2024/9/1447植物器官培养课件植物器官培养课件1.1.定义：定义： 种子培养是指受种子培养是指受精后发育完全的精后发育完全的成熟种子和发育成熟种子和发育不完全的未成熟不完全的未成熟种子的无菌培养种子的无菌培养2024/9/1448植物器官培养课件植物器官培养课件2. 2. 意义意义 ：：可以打破种子休眠，可以打破种子休眠，促进萌发；促进萌发；  通过胚胎拯救解决远缘杂种通过胚胎拯救解决远缘杂种败育性，产生后代；败育性，产生后代；快速繁殖苗木快速繁殖苗木 优点：植株分化容易，优点：植株分化容易，无菌操作方便无菌操作方便2024/9/1449植物器官培养课件植物器官培养课件 定义：定义：植物胚胎培养是指对植物的胚植物胚胎培养是指对植物的胚( (幼胚、成熟胚幼胚、成熟胚) )、、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。

的技术三、胚胎的培养三、胚胎的培养*2024/9/1450植物器官培养课件植物器官培养课件胚胎培养已有近百年的历史：胚胎培养已有近百年的历史：19041904年的年的HaningHaning最早成功地培养了萝卜和辣椒的胚，最早成功地培养了萝卜和辣椒的胚，并萌发形成小苗并萌发形成小苗3030年代年代 成功地把兰科植物的胚培养成小植株成功地把兰科植物的胚培养成小植株4040年代在苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、年代在苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、甘蓝与大白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养甘蓝与大白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养及子房与胚珠培养均取得了不同程度的进展及子房与胚珠培养均取得了不同程度的进展2024/9/1451植物器官培养课件植物器官培养课件（一）胚胎培养的意义（一）胚胎培养的意义克服远缘杂种的不育性克服远缘杂种的不育性 ；；使胚发育不全的植物获得后代；使胚发育不全的植物获得后代； 缩短育种年限缩短育种年限 ；；研究与胚发育有关的内外因素研究与胚发育有关的内外因素2024/9/1452植物器官培养课件植物器官培养课件（二）离体胚培养（二）离体胚培养 离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，一般可分为成熟胚和幼胚培养一般可分为成熟胚和幼胚培养。

2024/9/1453植物器官培养课件植物器官培养课件1.1.成熟胚培养成熟胚培养 指子叶期后至发育完全的胚指子叶期后至发育完全的胚培养较易成功，在含有大量无机元素和糖的基本培养基上，培养较易成功，在含有大量无机元素和糖的基本培养基上，就能正常生长成幼苗就能正常生长成幼苗将成熟或未成熟种子用将成熟或未成熟种子用70％酒精进行几秒钟的表面消毒％酒精进行几秒钟的表面消毒→无菌水冲洗无菌水冲洗3-4次次→无菌条件下进行解剖，取出胚并接种无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养在适当的培养基上培养2024/9/1454植物器官培养课件植物器官培养课件 培养基：培养基：White  Tukey   MS无机盐无机盐+糖糖(1-2%)+生长辅助物质生长辅助物质(激素、激素、AA、、活性炭、维生素等活性炭、维生素等)2024/9/1455植物器官培养课件植物器官培养课件幼胚是指子叶期以前的幼小胚幼胚是指子叶期以前的幼小胚由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，其研究应用越来越深入广泛其研究应用越来越深入广泛幼胚培养技术：心形期胚或更早期的胚（长度仅幼胚培养技术：心形期胚或更早期的胚（长度仅0.10.1～～0.20.2mmmm））胚越小就越难培养胚越小就越难培养 , ,幼胚培养成功的有大麦、荠菜、幼胚培养成功的有大麦、荠菜、甘蔗、甜菜、胡萝卜等甘蔗、甜菜、胡萝卜等 2. 2. 幼胚（未成熟胚）培养：幼胚（未成熟胚）培养：2024/9/1456植物器官培养课件植物器官培养课件（（1 1）未成熟胚胎的培养有三种不同的发育）未成熟胚胎的培养有三种不同的发育方式：方式：a. a. 继续进行正常的胚胎发育，维持继续进行正常的胚胎发育，维持““胚性生长胚性生长””；；b. b. 早熟萌发，即培养后迅速萌发成幼苗；早熟萌发，即培养后迅速萌发成幼苗；c. c. 胚在培养基中发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此胚在培养基中发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。

再分化形成多个胚状体或芽原基 2024/9/1457植物器官培养课件植物器官培养课件（（2 2）幼胚培养技术）幼胚培养技术幼胚培养的操作方法与成熟胚培养方法基本相同幼胚培养的操作方法与成熟胚培养方法基本相同值得注意值得注意的是切取幼胚必须在高倍解剖镜下进行，的是切取幼胚必须在高倍解剖镜下进行，操作时要细心，尽量取出完整的胚操作时要细心，尽量取出完整的胚幼胚培养成功的关键，是提供幼胚所必需的营养幼胚培养成功的关键，是提供幼胚所必需的营养和环境条件和环境条件2024/9/1458植物器官培养课件植物器官培养课件 ①①培养基培养基 幼胚对培养基要求较高，常用的培养基有幼胚对培养基要求较高，常用的培养基有TukeyTukey，，NitchNitch、、 MSMS，，B5B5培养基；培养基；通常存在的影响条件如下：通常存在的影响条件如下：2024/9/1459植物器官培养课件植物器官培养课件②②生长调节物质生长调节物质 不同植物的胚培养需要的生长物质不同不同植物的胚培养需要的生长物质不同如如IAAIAA可明显促进向日葵胚的生长；可明显促进向日葵胚的生长；IAAIAA，，KtKt的共同作用可促进荠菜幼胚的生长；的共同作用可促进荠菜幼胚的生长；一般认为一般认为IAAIAA可使胚的长度增加；可使胚的长度增加；加入加入BABA可提高胚的生存机会；可提高胚的生存机会；2024/9/1460植物器官培养课件植物器官培养课件③③天然提取物的作用天然提取物的作用 椰乳对胚培养有一定的促进作用（番茄胚在含有椰乳对胚培养有一定的促进作用（番茄胚在含有50%50%椰乳的培养基中可维持生长椰乳的培养基中可维持生长 ））一些瓜类的胚乳提取物能促进胚生长的能力。

一些瓜类的胚乳提取物能促进胚生长的能力 2024/9/1461植物器官培养课件植物器官培养课件④④温光条件温光条件 对于大多数植物的胚来说，在对于大多数植物的胚来说，在25-30℃25-30℃为宜为宜 早熟果树如桃的种胚，必须经过一定的低温春化阶段早熟果树如桃的种胚，必须经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长，而马铃薯胚以才能正常萌发生长，而马铃薯胚以20℃20℃为好光照可为好光照可以促进某些植物胚的转绿，利于胚芽生长，而黑暗则以促进某些植物胚的转绿，利于胚芽生长，而黑暗则利于胚根生长因此以光暗交替培养较为有利利于胚根生长因此以光暗交替培养较为有利2024/9/1462植物器官培养课件植物器官培养课件⑤⑤其它条件其它条件 胚培养中除要求较高的蔗糖（胚培养中除要求较高的蔗糖（4.5%4.5%）浓度、）浓度、高渗透压以外，还要求较高浓度的氨基酸及无机高渗透压以外，还要求较高浓度的氨基酸及无机盐 2024/9/1463植物器官培养课件植物器官培养课件(三三)胚珠培养胚珠培养１１. .定义：定义：胚珠培养是将授粉的子房在无菌条件下解剖后，取胚胚珠培养是将授粉的子房在无菌条件下解剖后，取胚珠置于培养基培养的过程。

有时也把胚珠连同胎座一珠置于培养基培养的过程有时也把胚珠连同胎座一起取下来培养起取下来培养2024/9/1464植物器官培养课件植物器官培养课件柱头柱头花柱花柱子房子房花梗花梗花托花托花组成花组成2024/9/1465植物器官培养课件植物器官培养课件胚囊胚囊卵细胞卵细胞珠心珠心珠珠   孔孔反足细胞反足细胞珠珠    被被胚　珠胚　珠极核极核 株柄株柄2024/9/1466植物器官培养课件植物器官培养课件2.2.意义：意义： 胚珠培养可以解决象兰科植物成熟胚较小不易培养的胚珠培养可以解决象兰科植物成熟胚较小不易培养的问题 另一方面在未受精的胚珠培养中，可诱发大孢子发另一方面在未受精的胚珠培养中，可诱发大孢子发育成单倍体，用于单倍体育种育成单倍体，用于单倍体育种 2024/9/1467植物器官培养课件植物器官培养课件3.3.培养技术：培养技术： 从花中取出子房从花中取出子房→ →70%酒精消毒酒精消毒30秒秒→ →无菌水冲洗无菌水冲洗→ →5%次氯酸钠液中灭菌次氯酸钠液中灭菌10分钟分钟→ →无菌水冲洗数次无菌水冲洗数次→ →在无菌条件下进行解剖在无菌条件下进行解剖→ →取出胚珠取出胚珠→ →放在培养基上放在培养基上→ →培养培养  基本培养基：用基本培养基：用Nistch培养基培养基  MS、、N6、、B5等培养基也可采用等培养基也可采用  关键：选择胚的发育时期关键：选择胚的发育时期——球形胚期的胚珠较易培养成功球形胚期的胚珠较易培养成功  2024/9/1468植物器官培养课件植物器官培养课件4.4.发育方式：发育方式：未受精胚珠未受精胚珠受精胚珠受精胚珠愈伤组织愈伤组织发育成种子发育成种子大孢子或卵分化为大孢子或卵分化为单倍体植株单倍体植株再生植株再生植株2024/9/1469植物器官培养课件植物器官培养课件( (四四) )子房培养子房培养1.1.取材：取材： 开花前开花前1 1－－5 5天摘下未授粉子房；天摘下未授粉子房； 或授粉后摘下子房。

或授粉后摘下子房2.2.灭菌：灭菌： 材料处理材料处理( (禾谷类植物用禾谷类植物用70%70%酒精擦洗幼穗；双子酒精擦洗幼穗；双子叶植物花蕾用饱和漂白粉灭菌叶植物花蕾用饱和漂白粉灭菌1515分分) → →70%) → →70%浸浸3030秒秒→ →→ →无菌水冲洗无菌水冲洗→ → 0.1%→ → 0.1%升汞升汞1515－－2020分钟分钟→ →→ →无无菌水冲洗菌水冲洗→ →→ →无菌滤纸吸干无菌滤纸吸干2024/9/1470植物器官培养课件植物器官培养课件3.3.接种：接种：    无菌条件下剥开幼花，夹出子房并接种于培养基（无菌条件下剥开幼花，夹出子房并接种于培养基（MS、、N6等）4.4.培养：培养：    温度温度26℃,相对湿度相对湿度50-60%，，16h散射光2024/9/1471植物器官培养课件植物器官培养课件 胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的三倍体组织成的三倍体组织 由它可获得无子结实的三倍体植株，进而可将它由它可获得无子结实的三倍体植株，进而可将它加倍成六倍体植株。

加倍成六倍体植株 (五五) )胚乳的培养胚乳的培养2024/9/1472植物器官培养课件植物器官培养课件 培养方法：培养方法： 1. 取材与接种取材与接种   取授粉取授粉4-8d后的幼果后的幼果→常规消毒常规消毒→在无菌条在无菌条件下切开果实件下切开果实 → 取出种子取出种子 → 分离出胚乳分离出胚乳 → 接种接种  2. 培养基培养基:     MS、、White + 2，，4-D（（NAA，，0.5-2.0mg/L ）） + 6-BA，，0.1-1.0mg/L 2024/9/1473植物器官培养课件植物器官培养课件3.3.培养培养 在在25-27℃25-27℃，黑暗条件或散射光下培养约，黑暗条件或散射光下培养约6-l0d6-l0d胚乳开始膨大胚乳开始膨大→→形成愈伤组织形成愈伤组织→→分化培养基上（分化培养基上（ 附附加加6-BA6-BA，， 0.5-3.0mg/L0.5-3.0mg/L，少量的，少量的NAANAA ）培养）培养→ → 待愈待愈伤组织长出芽后，取下不定芽伤组织长出芽后，取下不定芽→→生根培养基生根培养基→→光下光下培养培养10-15d10-15d，切口处可长出白色的不定根。

切口处可长出白色的不定根2024/9/1474植物器官培养课件植物器官培养课件植物器官培养课件植物器官培养课件第第4节节 植物组织与器官培养植物组织与器官培养 实例实例v植物组织培养：将离体的植物组织（器官、植物组织培养：将离体的植物组织（器官、细胞、胚胎、原生质体）等在适当的培养条细胞、胚胎、原生质体）等在适当的培养条件，长成完整植株的技术件，长成完整植株的技术{诱发产生愈伤诱发产生愈伤组织、潜伏芽组织、潜伏芽}v植物器官培养：植物器官培养：将诱导的或植株将诱导的或植株上原有的各种器官，上原有的各种器官，放在无菌的人工环境放在无菌的人工环境中让其进一步发育，中让其进一步发育，最终长成幼苗或大量繁殖最终长成幼苗或大量繁殖的过程2024/9/1476植物器官培养课件植物器官培养课件植物离体无性繁殖植物离体无性繁殖v简称离体繁殖简称离体繁殖（in vitroin vitro propagation propagation)、微微型繁殖型繁殖（micropropagationmicropropagation)，是指利用离体是指利用离体培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，并在短期内获得大量遗传性一致的植株的方并在短期内获得大量遗传性一致的植株的方法（技术）。

法（技术）v用这种方法得到的植株群体称单株无性系用这种方法得到的植株群体称单株无性系来自一个单株（或一个单芽），它们遗传组成相同来自一个单株（或一个单芽），它们遗传组成相同)近近400种植物离体繁殖已获成功兰花、无子西瓜、马铃薯、种植物离体繁殖已获成功兰花、无子西瓜、马铃薯、杨树等已在种苗生产上广泛应用杨树等已在种苗生产上广泛应用植物器官培养课件植物器官培养课件植物离体无性繁殖的意义（优越性）植物离体无性繁殖的意义（优越性）繁殖速度快，经济效益高繁殖速度快，经济效益高占用空间小，不受地区季节限占用空间小，不受地区季节限制，便于工厂化育苗制，便于工厂化育苗可以繁殖各种珍稀、涉危苗木可以繁殖各种珍稀、涉危苗木离体繁殖周期：离体繁殖周期：1～～3个月个月繁殖系数：几十～繁殖系数：几十～几百倍几百倍又称快繁又称快繁离体繁殖是建立在体离体繁殖是建立在体细胞系的基础上，细胞系的基础上，是在人工控制的环是在人工控制的环境条件下，不会造境条件下，不会造成性状分离，也不成性状分离，也不会退化，同时还可会退化，同时还可避免病虫害的侵染避免病虫害的侵染利于筛选突变体，为育种服务利于筛选突变体，为育种服务植物器官培养课件植物器官培养课件手指玫瑰手指玫瑰 由根由根组织培养组织培养的蒲的蒲公英幼苗公英幼苗植物器官培养课件植物器官培养课件植物离体无性繁殖的方式植物离体无性繁殖的方式v器官发生型器官发生型(organogenesis type)(organogenesis type)v胚状体发生型胚状体发生型(embryogenesis type)(embryogenesis type)v不定芽型（不定芽型（adventitious bud type)adventitious bud type)v器官型器官型(organ type)(organ type)v原球茎型原球茎型(protocorm type)(protocorm type)v球茎芽型球茎芽型 v块茎型块茎型v鳞茎型鳞茎型v孢子型孢子型v根茎型根茎型 v微枝扦插型微枝扦插型 植物器官培养课件植物器官培养课件器官发生型器官发生型(organogenesis type)(organogenesis type)：：v诱导器官外植体产生诱导器官外植体产生愈伤组织愈伤组织，经分化培，经分化培养形成芽、根再生成植株的方式。

养形成芽、根再生成植株的方式v技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早期挑选，使其来源尽量一致期挑选，使其来源尽量一致v特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再生成植株，遗传性不稳定，易产生变生成植株，遗传性不稳定，易产生变异芦荟、烟草、油菜等芦荟、烟草、油菜等 植物器官培养课件植物器官培养课件无菌母株制备无菌母株制备增殖、分化增殖、分化植株再生及鉴定植株再生及鉴定炼苗和移植炼苗和移植器器官官发发生生型型基基本本程程序序培养基中激素配比培养基中激素配比激素种类及浓度激素种类及浓度基本培养基组成基本培养基组成渗透压渗透压逐步过渡逐步过渡培养基筛选培养基筛选材料灭菌材料灭菌2024/9/1482植物器官培养课件植物器官培养课件胚状体发生型胚状体发生型(embryogenesis type)(embryogenesis type)：：v指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱分化形成胚状体再成苗的方式分化形成胚状体再成苗的方式v技术关键：提高不同外植体胚状体发生及技术关键：提高不同外植体胚状体发生及萌发率和提高胚状体同步化率。

萌发率和提高胚状体同步化率v特点：胚状体发生数量多、速度快、结构特点：胚状体发生数量多、速度快、结构完整，繁殖系数高；遗传性稳定完整，繁殖系数高；遗传性稳定甘蔗、胡萝卜、石刁柏等甘蔗、胡萝卜、石刁柏等 植物器官培养课件植物器官培养课件不定芽型（不定芽型（adventitious bud type)adventitious bud type)：：v选取具有顶芽和腋芽的短枝选取具有顶芽和腋芽的短枝无菌培养，诱导芽萌发成苗无菌培养，诱导芽萌发成苗或增殖产生许多不定芽发育或增殖产生许多不定芽发育成苗，将新萌生的枝条再转成苗，将新萌生的枝条再转接继代，重复芽到苗的增殖接继代，重复芽到苗的增殖过程，最后使其生根形成植过程，最后使其生根形成植株的方式株的方式v技术关键：打破顶端优势，技术关键：打破顶端优势，促使腋芽增殖并促其生根促使腋芽增殖并促其生根v特点：繁殖率高、保持物种特点：繁殖率高、保持物种的遗传稳定性，多用于林木的遗传稳定性，多用于林木的繁殖FLash植物器官培养课件植物器官培养课件器官型器官型(organ type)(organ type)v指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球茎、小块茎）产生再生成植株的方式。

茎、小块茎）产生再生成植株的方式v技术关键：对培养基要求高，控制好激素技术关键：对培养基要求高，控制好激素浓度，避免愈伤组织发生浓度，避免愈伤组织发生v优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、丝石竹等丝石竹等 植物器官培养课件植物器官培养课件原球茎型原球茎型(protocorm type)(protocorm type)v兰属特有的方式，兰属特有的方式，即外植体经培养即外植体经培养产生原球茎，再产生原球茎，再直接长成植株直接长成植株植物器官培养课件植物器官培养课件球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型球茎芽型 叶柄表面产生圆球形小突起叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，球茎芽，一端出芽一端出根一端出芽一端出根 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植中种植 唐唐菖菖蒲蒲观观叶叶海海棠棠植物器官培养课件植物器官培养课件块茎型块茎型 v叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分化出芽和根化出芽和根v块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖移栽，成活率高移栽，成活率高 。

v花叶芋花叶芋 植物器官培养课件植物器官培养课件鳞茎型鳞茎型 v鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎 v在试管内形成小鳞茎需较长时间在试管内形成小鳞茎需较长时间 v百合百合 郁金香郁金香植物器官培养课件植物器官培养课件孢子型孢子型 v用成熟或未成熟的孢子进行培养用成熟或未成熟的孢子进行培养 v孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时间较长间较长 v地钱地钱狼尾蕨狼尾蕨植物器官培养课件植物器官培养课件根茎型根茎型 v蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为组织培养的最佳外植体组织培养的最佳外植体 v根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢子型快子型快v肾蕨等肾蕨等 植物器官培养课件植物器官培养课件微枝扦插型微枝扦插型 带芽的小插条在试管内进行无菌扦插带芽的小插条在试管内进行无菌扦插 为木本植物进行快速繁殖的主要方式为木本植物进行快速繁殖的主要方式 葡萄、杨树葡萄、杨树 植物器官培养课件植物器官培养课件培养基无机盐无机盐无机盐培养基的组成培养基的组成大量元素大量元素大量元素大量元素( (使用浓度大于使用浓度大于使用浓度大于使用浓度大于0.5mmol/L)0.5mmol/L)微量元素微量元素微量元素微量元素( (使用浓度小于使用浓度小于使用浓度小于使用浓度小于0.5mmol/L)0.5mmol/L)2024/9/1493植物器官培养课件植物器官培养课件无机盐2024/9/1494植物器官培养课件植物器官培养课件有机物有机物›氨基酸类氨基酸类 重要的有机氮源重要的有机氮源›维生素类维生素类 以辅酶形式参与植物细胞以辅酶形式参与植物细胞代谢活动，对生长、分化具有很好的促代谢活动，对生长、分化具有很好的促进作用进作用 vb1，， vb6›糖类糖类 主要的碳源主要的碳源—蔗糖？蔗糖？›天然有机添加物类天然有机添加物类 CM（椰乳）、（椰乳）、马铃薯汁、酵母提取液（马铃薯汁、酵母提取液（YE）、番茄汁）、番茄汁等等2024/9/1495植物器官培养课件植物器官培养课件蔗糖浓度分别为蔗糖浓度分别为0 0、、1%1%、、5%5%2024/9/1496植物器官培养课件植物器官培养课件调节物质（一）生长素类（一）生长素类 促进细胞伸长生长和分裂、促进细胞伸长生长和分裂、诱导愈伤组织形成、促进生根，与一定量的诱导愈伤组织形成、促进生根，与一定量的细胞分裂素配合可诱导不定芽的分化、侧芽细胞分裂素配合可诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的产生等。

的萌发与生长、胚状体的产生等›常用的有常用的有2,4-D2,4-D、、NAANAA、、IBAIBA、、IAAIAA›IAAIAA为天然植物生长素，见光易分解，高温高压为天然植物生长素，见光易分解，高温高压易受破坏；易受破坏；›2,4-D2,4-D有抑制芽形成的作用，一般用于细胞启动有抑制芽形成的作用，一般用于细胞启动脱分化阶段；脱分化阶段；›诱导分化则用诱导分化则用NAANAA、、NBANBA或或IAAIAAIBAIBA诱导生根效果诱导生根效果最好2024/9/1497植物器官培养课件植物器官培养课件（二）细胞分裂素类（二）细胞分裂素类 促进细胞分裂、诱导愈伤组织或器官分化促进细胞分裂、诱导愈伤组织或器官分化不定芽、解除顶端优势而促进侧芽增殖、不定芽、解除顶端优势而促进侧芽增殖、抑制离体组织或器官衰老抑制离体组织或器官衰老›常用的有常用的有6-BA、、 KT 、、 ZT6-BA6-BA2024/9/1498植物器官培养课件植物器官培养课件BA分别为分别为0, 0.1, 5mg/LNAA分别为分别为0, 0.1, 5mg/L2024/9/1499植物器官培养课件植物器官培养课件（三）赤霉素类（三）赤霉素类 主要应用主要应用GA3，促进体细胞胚发育成小植，促进体细胞胚发育成小植株，株，GA3不耐热，水溶解后不稳定，应采不耐热，水溶解后不稳定，应采用过滤除菌，并用酒精溶解。

用过滤除菌，并用酒精溶解脱落酸脱落酸 抑制蛋白质合成，抵消和抑制上述三种激抑制蛋白质合成，抵消和抑制上述三种激素发挥作用；诱导休眠、促进衰老和脱落素发挥作用；诱导休眠、促进衰老和脱落乙烯乙烯2024/9/14100植物器官培养课件植物器官培养课件植物细胞工程培养基配制植物细胞工程培养基配制v培养基母液的配制培养基母液的配制›大量元素一般配成大量元素一般配成10倍浓度的母液；倍浓度的母液；›微量元素和有机营养常配成微量元素和有机营养常配成100倍浓度的母液；倍浓度的母液；›混合定容时，注意药剂的添加顺序及稀释度，以混合定容时，注意药剂的添加顺序及稀释度，以免沉淀；免沉淀；›生长调节类物质不溶于水生长调节类物质不溶于水,需用不同溶剂进行溶解需用不同溶剂进行溶解›单独配制的试剂：单独配制的试剂：v铁盐与铁盐与EDTAvCaCl2 前前P282024/9/14101植物器官培养课件植物器官培养课件以以KNO3为例为例1L培养基需要量为培养基需要量为19g在配制母液时，增加在配制母液时，增加10倍量，为倍量，为190g。

在母液中的浓度为在母液中的浓度为190g/L，即，即0.19g/ml在配制培养基时，取在配制培养基时，取10ml，，10ml×0.19g/ml=19g回回P262024/9/14102植物器官培养课件植物器官培养课件植物细胞工程培养基配制植物细胞工程培养基配制v培养基配制过程培养基配制过程›药品药品 按顺序混合按顺序混合 pHpH调整调整 加热溶解加热溶解›器皿器皿 水洗水洗 干燥干燥 分装培养基分装培养基 加塞加塞 冷却冷却 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 2024/9/14103植物器官培养课件植物器官培养课件常用培养基常用培养基v到目前研制开发了数十种适宜不同植物、不到目前研制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的培养基配方同组织、不同细胞生长发育的培养基配方但多数培养基配方是在几种普遍应用的培养但多数培养基配方是在几种普遍应用的培养基上演变而来的基上演变而来的v这几种常见的培养基为是：这几种常见的培养基为是：MS、、ER、、B5、、N6、、NT、、White等，其配方如下：等，其配方如下：2024/9/14104植物器官培养课件植物器官培养课件2024/9/14105植物器官培养课件植物器官培养课件培养基分类培养基分类v根据培养基无机盐含量的差异将其分为以根据培养基无机盐含量的差异将其分为以下下4类：类：①①高无机盐含量培养基（植物器官、花药、高无机盐含量培养基（植物器官、花药、细胞及原生质体培养）；细胞及原生质体培养）；-MS②②较高硝酸盐含量培养基（木本、十字花科较高硝酸盐含量培养基（木本、十字花科和单子叶植物的组织和花药培养）；和单子叶植物的组织和花药培养）；-B5③③中等无机盐含量培养基（花药培养）；中等无机盐含量培养基（花药培养）；-H④④低无机盐含量培养基（生根）。

低无机盐含量培养基（生根）WHITE2024/9/14106植物器官培养课件植物器官培养课件植物组织培养问题分析植物组织培养问题分析试管苗玻璃化现象（试管苗玻璃化现象（vitrificationvitrification）） 是指组织培养过程中的特有的一种生理失是指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象态异常的现象v 玻璃化苗绝大多数为玻璃化苗绝大多数为 来自茎尖或茎段来自茎尖或茎段 培养物的不定芽培养物的不定芽v 通常玻璃化苗通常玻璃化苗 恢复正常的比例很低，恢复正常的比例很低， 在继代培养中仍然在继代培养中仍然 形成玻璃化苗形成玻璃化苗2024/9/14107植物器官培养课件植物器官培养课件玻璃化的解决方法玻璃化的解决方法1.增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；水势；2.减少培养基中减少培养基中NH4+浓度；浓度；3.增加光照；增加光照；4.增加容器通风，最好进行增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；5.降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；试管苗玻璃化的现象发生；6.降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。

入适量脱落酸2024/9/14108植物器官培养课件植物器官培养课件褐变问题褐变问题v成因›酶促----酚氧化成醌及聚合›非酶促----醌聚合v时段›初代培养初代培养›继代培养继代培养2024/9/14109植物器官培养课件植物器官培养课件① ① 选择合适的外植体选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻植体，这样可以使褐变现象明显减轻② ② 合适的培养条件合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象③ ③ 使用抗氧化剂使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象④ ④ 材料预处理和细胞筛选材料预处理和细胞筛选⑤⑤ 使用吸附剂使用吸附剂 0.1%-0.5%0.1%-0.5%的活性炭的活性炭、、PVP对防止褐变也有较为对防止褐变也有较为明显的效果。

明显的效果⑥⑥ 连续转移连续转移 对容易褐变的材料可间隔对容易褐变的材料可间隔12~24h12~24h的培养后，再转的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d7-l0d后，褐变现象便后，褐变现象便会得到控制或大为减轻会得到控制或大为减轻减轻褐变现象发生的方法减轻褐变现象发生的方法2024/9/14110植物器官培养课件植物器官培养课件微生物污染问题微生物污染问题v原因原因›消毒不彻底消毒不彻底v外植体消毒问题外植体消毒问题v培养基及器皿消毒问题培养基及器皿消毒问题v环境消毒问题环境消毒问题›无菌操作不过关无菌操作不过关2024/9/14111植物器官培养课件植物器官培养课件外植体消毒问题外植体消毒问题外植体取材外植体取材 外植体外植体(expant)是指用于离体培养的活的是指用于离体培养的活的植物组织植物组织来源：来源：2024/9/14112植物器官培养课件植物器官培养课件外植体消毒问题外植体消毒问题外植体灭菌的过程：外植体灭菌的过程：流水冲洗流水冲洗10~20min表面消毒表面消毒无菌水冲洗无菌水冲洗4~5次次 沥水待用沥水待用 Flash2024/9/14113植物器官培养课件植物器官培养课件常用消毒剂消毒灭菌效果比较常用消毒剂消毒灭菌效果比较消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度%去除的难易去除的难易 消毒时间消毒时间min 效果效果次氯酸钙次氯酸钙次氯酸钠次氯酸钠漂白粉漂白粉溴水溴水过氧化氢过氧化氢升汞升汞酒精酒精抗生素抗生素硝酸银硝酸银9~102饱和溶液饱和溶液1~210~120.1~170~754~5(mg/L)1易易易易易易易易最易最易较难较难易易中中较难较难5~305~305~302~105~152~100.2~230~605~30很好很好很好很好很好很好很好很好好好最好最好好好较好较好好好2024/9/14114植物器官培养课件植物器官培养课件容器容积容器容积（（mL））121℃下所需的最下所需的最少灭菌时间少灭菌时间( (min））20~5075250~500100015002000152025303540培养基及器皿消毒灭菌问题培养基及器皿消毒灭菌问题培养基高压蒸汽灭菌所需的最少时间培养基高压蒸汽灭菌所需的最少时间2024/9/14115植物器官培养课件植物器官培养课件培养基灭菌培养基灭菌ØØ 培养基组成中若含有遇热易分解物质，培养基组成中若含有遇热易分解物质，如如 生长调节物质、维生素、尿素、酶等，生长调节物质、维生素、尿素、酶等，则必须用过滤法除菌。

则必须用过滤法除菌ØØ 过滤除菌时，使用孔径为过滤除菌时，使用孔径为0.22~0.45μm或更小的细菌滤膜或更小的细菌滤膜ØØ 过滤除菌可利用抽滤装置或注射过滤器过滤除菌可利用抽滤装置或注射过滤器进行，所用器皿均应经过高压消毒灭菌，进行，所用器皿均应经过高压消毒灭菌，灭菌温度不超过灭菌温度不超过121℃2024/9/14116植物器官培养课件植物器官培养课件器皿消毒灭菌器皿消毒灭菌v手术刀手术刀v镊子镊子v平皿平皿v干热灭菌干热灭菌 150-160℃℃，，2h 2024/9/14117植物器官培养课件植物器官培养课件环境消毒问题环境消毒问题2024/9/14118植物器官培养课件植物器官培养课件无菌操作问题无菌操作问题评价下列操作正确与否评价下列操作正确与否2024/9/14119植物器官培养课件植物器官培养课件评价下列操作正确与否评价下列操作正确与否2024/9/14120植物器官培养课件植物器官培养课件评价下列操作正确与否评价下列操作正确与否2024/9/14121植物器官培养课件植物器官培养课件评价下列操作正确与否评价下列操作正确与否2024/9/14122植物器官培养课件植物器官培养课件无菌操作无菌操作v无菌操作前的准备工作无菌操作前的准备工作›无菌操作台的使用无菌操作台的使用›操作所用器械应浸泡在操作所用器械应浸泡在95%酒精中，用前需放在酒精中，用前需放在耐热器皿中加入少量酒精后进行灼烧，每次使用耐热器皿中加入少量酒精后进行灼烧，每次使用后都要灭菌。

后都要灭菌v无菌操作步骤无菌操作步骤›外植体的适当切割的注意事项外植体的适当切割的注意事项›继代培养的材料继代培养的材料( (液体材料、固体材料）液体材料、固体材料）2024/9/14123植物器官培养课件植物器官培养课件3.1.4.4 其他问题v培养条件控制培养条件控制激素水平激素水平光照：时间，强度和光质光照：时间，强度和光质温度：适温有利于细胞分裂与分化，而在一温度：适温有利于细胞分裂与分化，而在一定范围内降低培养温度可以使细胞的质量定范围内降低培养温度可以使细胞的质量增加；培养基昼夜变温可能有利于器官的增加；培养基昼夜变温可能有利于器官的发生pH pH 通常使用的通常使用的pHpH值的范围是值的范围是5.55.5－－6.56.5pH<4pH<4或或>7>7，培养物不能正常生长培养物不能正常生长气体气体2024/9/14124植物器官培养课件植物器官培养课件激素水平的控制激素水平的控制v生长素应用的浓度范围为生长素应用的浓度范围为0.1~15mg/L›在细胞脱分化过程中，启动细胞分裂形在细胞脱分化过程中，启动细胞分裂形成愈伤组织，以成愈伤组织，以2,4-D最为有效最为有效›细胞脱分化需要高浓度的细胞脱分化需要高浓度的2,4-D，当胚，当胚性细胞形成转入再分化时，则需较低的性细胞形成转入再分化时，则需较低的2,4-D浓度。

浓度v使用浓度范围为使用浓度范围为0.1~10mg/L›细胞分裂素既可诱导细胞分裂，又可调节细细胞分裂素既可诱导细胞分裂，又可调节细胞分化2024/9/14125植物器官培养课件植物器官培养课件16h/d24h/d0h/d光照时间的影响光照时间的影响光照时间的影响光照时间的影响2024/9/14126植物器官培养课件植物器官培养课件液体振荡培养的愈伤组织生长与振荡频率的关系液体振荡培养的愈伤组织生长与振荡频率的关系2024/9/14127植物器官培养课件植物器官培养课件3.2 植物胚胎培养Flash2024/9/14128植物器官培养课件植物器官培养课件概念概念花药培养属于花药培养属于器官培养范畴器官培养范畴花粉培养属于花粉培养属于细胞培养范畴细胞培养范畴也称小孢子培养也称小孢子培养花药及花粉培养花药及花粉培养把发育到一定阶段的花药接种在人把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成植工培养基上，使其发育和分化成植株的过程株的过程从花药中分离出花粉粒使之成为分散或游离的状态，通过从花药中分离出花粉粒使之成为分散或游离的状态，通过培养使其脱分化并发育成植株的过程培养使其脱分化并发育成植株的过程2024/9/14129植物器官培养课件植物器官培养课件v获得单倍体植株获得单倍体植株v花药培养的基本程序：花药培养的基本程序： Flash›选处于生殖生长高峰期的花药，需低选处于生殖生长高峰期的花药，需低温预处理（温预处理（3～～10℃℃，，2～～10天），光天），光照先弱后强。

照先弱后强花药培养花药培养目的及程序目的及程序2024/9/14130植物器官培养课件植物器官培养课件花粉或小孢子的分离花粉或小孢子的分离花粉或小孢子培养目的及方法花粉或小孢子培养目的及方法目的：获得单倍体植株目的：获得单倍体植株2024/9/14131植物器官培养课件植物器官培养课件花药看护培养花药看护培养花粉悬浮培养花粉悬浮培养固液双层培养固液双层培养花花粉培养方法粉培养方法2024/9/14132植物器官培养课件植物器官培养课件2024/9/14133植物器官培养课件植物器官培养课件毛状根培养毛状根培养v定义：毛状根定义：毛状根(hairy roots)是（双子叶）植株是（双子叶）植株或组织、器官经发根农杆或组织、器官经发根农杆菌（菌（Agrobacterium rhizogenes）感染后，）感染后，形成的类似头发一样的根形成的类似头发一样的根组织又称发状根又称发状根   1934年，年，Hildebrand  报道了发根农杆菌感报道了发根农杆菌感染苹果树产生发根染苹果树产生发根 2024/9/14134植物器官培养课件植物器官培养课件 毛状根的特性毛状根的特性v特性：特性：›毛状根可以不依赖激素快速生长，根多丛生，毛状根可以不依赖激素快速生长，根多丛生，多分枝，多根毛，无向地性。

多分枝，多根毛，无向地性›生理生化和遗传稳定生理生化和遗传稳定v为什么可以不依赖激素？为什么可以不依赖激素？›发根农杆菌的发根农杆菌的Ri质粒上的质粒上的T-DNA片断整合进片断整合进植物细胞核基因组中植物细胞核基因组中›T-DNA上有生长素合成基因上有生长素合成基因tms 1 和和tms 2能能够指导够指导IAA的合成 2024/9/14135植物器官培养课件植物器官培养课件 毛状根的诱导毛状根的诱导外植体接种法外植体接种法 ---共培养共培养 茎秆接种法茎秆接种法原生质体原生质体-农杆菌共培养法农杆菌共培养法2024/9/14136植物器官培养课件植物器官培养课件生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素v青蒿：为双子叶植物药菊科植物青蒿：为双子叶植物药菊科植物v青蒿素：青蒿素：Ø倍半萜内酯类化合物倍半萜内酯类化合物Ø功效：治疗疟疾功效：治疗疟疾2024/9/14137植物器官培养课件植物器官培养课件1.Bioreactor, 2.Concentric draught cylinder, 3.Stainless stell mesh, 4.Air outlet, 5.Timer, 6.Mist nozzle, 7.Medium, 8.Air inlet, 9.Air filter, 10.Flowmeter, 11. Holes on draught cylinder, 12.Electromagnetic valve, 13.Air storage tank, 14.Nebulizing device, 15.  40W fluorescent lamp2024/9/14138植物器官培养课件植物器官培养课件2024/9/14139植物器官培养课件植物器官培养课件生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素2024/9/14140植物器官培养课件植物器官培养课件　　Growth feature of Artemisia annua adventitious shoot in the mist bioreactor   (a) 0 d ; (b) 10 d ;10cm30cm2024/9/14141植物器官培养课件植物器官培养课件生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素素v实验材料实验材料›青蒿毛状根：青蒿毛状根：由发根农杆菌由发根农杆菌R1601诱导青蒿叶片产生诱导青蒿叶片产生v培养方法及条件培养方法及条件1. 固体培养固体培养›20～～30 mm青蒿毛状根根尖青蒿毛状根根尖›MS固体培养基固体培养基(添加添加30 L蔗糖蔗糖)›继代时同为继代时同为15d2024/9/14142植物器官培养课件植物器官培养课件生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素v培养方法及条件2. 液体振荡培养（三角瓶）›接种量：每L培养液（MS）5 g 毛状根培养物（分支多且细长的毛状根）›120-130 rpm，25±1 ℃，12 h／d光照›液体培养的继代时间为10 d。

3.反应器培养›反应器中的培养液(MS)为400mL，接种量为0.8g›12 h／d培养，25±I℃ ›雾化间隔30 min，雾化2min›通气量为0.5 L／min，通气时间为15 mln2024/9/14143植物器官培养课件植物器官培养课件v最大生物量最大生物量10.3g/L，青蒿素产量达到，青蒿素产量达到179.1mg/L，青蒿，青蒿素的含量为素的含量为1.74％2024/9/14144植物器官培养课件植物器官培养课件小结小结v外植体选择是植物组织培养的基本环节，应外植体选择是植物组织培养的基本环节，应根据不同培养目的确定取材原则根据不同培养目的确定取材原则v通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？2024/9/14145植物器官培养课件植物器官培养课件。