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病毒中和抗体检测1. 病毒TCID50检测TCID50 是指组织培养物〔细胞〕半数致死剂量它有几个性质我们必须明白：1〕它表示的是计量，不是浓度； 2〕它是一个单位；3〕它的值等于1，实际上问它的值等于多少是一个没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说出的的值等于多少，那我们只能说它的值在任何情况下都等于1理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但是这三个性质经常被误解，所以导致对TCID50的理解出现偏差首先我们来看一下这个表示法的意思：病毒滴度为108.2TCID50/ml 它表示的是每ml病毒溶液里含有108.2个TCID50的病毒，这和氯化钠的浓度为4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5个mol的氯化钠是一样的道理经常可以听到人说我的病毒的TCID50是10*.*这个说法是不科学的，应该说我这个溶液里含有10*.*个TCID50的病毒或者说我这个溶液的病毒滴度是10**TCID50/ml也可以说病毒的TCID50效价是10-*.*TCID50=10^5.64/0.1ml即：将病毒悬液作10^5.64稀释后，接种细胞0.1ml，可以使50%的细胞产生CPE〔将病毒悬液作10^5.64稀释后，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时〔如中和试验〕，一般常用100TCID50/0.1ml或者100TCID50/0.05ml〕本方法的优缺点:①.优点:出现阳性结果时间较短,且较明显;②.缺点:有时候,在用枪头吸出细胞生长液时,容易出现污染;使用本方法时的本卷须知:①.稀释病毒时,每做一个病毒稀释度都需要换枪头,减少浓度误差;②.96孔板,每孔接种的细胞量:一般在此种测定病毒滴度的方法下,要将细胞密度适当调低,至少要比正常传代时低一些,否则细胞生长速度过快,未到7天则细胞出现死亡,对观察CPE不利.一般情况下,小塑料瓶(8-9ml液体为正常用量),培养长慢单层后,消化细胞,参加6ml培养液,吹匀,吸出其中的2ml,到另外的瓶子,在该瓶中参加14-16ml即可,如果不放心,可以用显微镜看一下,细胞数过多则补加培养液,少则补加剩余4ml的细胞悬液;维持液,即病毒培养液,配方为:①.MEM+2%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;②. MEM+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;两种维持液的不同在于是否有FBS(小牛血清).我个人曾经做过实验,在状态很好的细胞上接种病毒,分别使用两种不同的维持液,最终结果是一样的,没有什么不同,所以可以根据个人需要进展选择.另外,曾经请教过专门做中和实验的教师,他认为适当的FBS对细胞有保护作用,而且他说这是国外文献上的报道. 1） 细胞准备1.1 检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶－EDTA轻微冲洗1.2 参加4－5ml 胰酶－EDTA以覆盖单层细胞1.3 放平培养瓶，37℃ 5％CO2培养箱中孵育10－20min，直到细胞脱落1.4 参加5－10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中1.5 以PBS洗细胞两次〔12000rpm, 5min〕1.6 以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数1.7 以D-MEM将将细胞浓度调整到1×10^5/ml --1.5×10^5/ml1.8 在微量培养板的各孔中参加100μl细胞, 相当于"×10^4细胞/孔1.9 在37℃ 5％CO2培养箱中过夜培养〔18－22h〕，用处于生长相刚到达完全融合的细胞进展病毒的滴定2〕 病毒制备3〕病毒稀释3.1 取冻存的病毒，以病毒生长培养液〔VGM〕稀释10倍，即100微升病毒液+900微升稀释液，共1毫升。

〔于1.5ML EP管中进展，将混合液充分吹打振荡，很重要！〕3.2 做10倍稀释3.3 在另一新1.5ML EP管中参加100μl第一管稀释病毒液〔1/10〕，按10的比例进展倍比稀释，再参加900μl稀释液，将混合液充分吹打振荡以此类推共稀释至10^13倍此过程中需要使用加样器和tip头使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌使用新高压的tip头，外包装一定在超净台〔或平安柜中翻开〕4〕 病毒接种：4.1取细胞培养板，用多道加样器〔又称排枪〕吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液或无血清DMEM加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液〔此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附〕4.2  于各孔中加100ul各不同的病毒稀释液，每个稀释度做一列孔，即每个病毒稀释度做8个平行复孔，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度到原液加样病毒稀释度的选择10^3—10^12或者10^4—10^13,因为目的基因不同，重组腺病毒滴度差距很大，应该尽量将稀释度加大，看到有人用的稀释度是10^6—10^13)4.3  第11列和12列为阴性对照，阴性对照孔中参加100ul含5%胎牛血清的DMEM，监测细胞存活情况；切记：设置正常的细胞对照。

每次实验要重复4次，计算标准差3456789101112CONCONABCDEFGH4.437℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液〔从低浓度向高浓度吸取可防止窜孔〕，参加维持液200µl继续于37℃，5% CO2培养5--10天；4.5逐日观察，5--10天后倒置显微镜下观察，计算每一列中出现CPE〔cytopathic effects，CPEs〕的孔数只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较；4.6  如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本试验即为有效；4.7  计算每一列中出现阳性的孔数；4.8  用Reed-Muench法计算病毒TCID50/ml1)计算各病毒稀释度阳性孔数目〔1〕和阴性孔数目〔2〕(2)计算阳性和阴性孔的累积数阳性孔累积数由下向上累计〔3〕；阴性孔累积数由上向下累计〔4〕(3)计算阳性孔的百分比：比率〔5〕=〔3〕/〔〔3〕+〔4〕〕，〔6〕=〔5〕×100(4)计算距离比例〔PD〕=〔大于50%的阳性百分比－50〕/〔大于50%的阳性百分比－小于50%的阳性百分比〕TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数 + 距离比例×稀释系数的对数〔稀释系数的对数1:10稀释为1，半对数稀释为0.5，倍比稀释为0.3，1:5稀释为0.7〕举例计算：TCID50的测定和计算〔Reed-Muench法〕病毒液稀释度细胞管观察结果累计细胞官数细胞管总数出现CPE的细胞管所占的％出现CPE管不出现CPE管出现CPE管不出现CPE管10-18027027100〔27/27〕10-28019019100(19/19)10-3711111291.6(11/12)10-435461040(4/10)10-517113140.7(1/14)10-608021210(0/21)出现细胞病变〔CPE〕以及血凝素等的细胞管数分别列于表14-2的第二和第三列,它们的累计数分别列于第四和第五列〔根据箭头所示方向〕,第六列为细胞管总数,第七列为出现细胞病变的细胞管数占细胞管总数的百分率。

可见该病毒株的TCID50在10-3〔91.6％〕和10-4〔40％〕之间,其确切稀释倍数可按以下公式计算：91.6〔高于50％的百分数〕-50 91.6〔高于50％的百分数〕-40〔低于50％的百分数〕＝41.6/51.6＝0.8将由上式获得0.8加在高于50%死亡的稀释度的对数〔3〕上,因此该病毒的TCID50应是0.1ml 10-3.8稀释的病毒液查反对数得6310,即该病毒6310倍稀释液0.1ml等于1个TCID502. 中和实验1） 细胞准备1.1 检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶－EDTA轻微冲洗1.2 参加4－5ml 胰酶－EDTA以覆盖单层细胞1.3 放平培养瓶，37℃ 5％CO2培养箱中孵育10－20min，直到细胞脱落1.4 参加5－10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中1.5 以PBS洗细胞两次〔12000rpm, 5min〕1.6 以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数1.7 以D-MEM将将细胞浓度调整到1×10^5/ml --1.5×10^5/ml1.8 在微量培养板的各孔中参加100μl细胞, 相当于"×10^4细胞/孔1.9 在37℃ 5％CO2培养箱中过夜培养〔18－22h〕，用处于生长相刚到达完全融合的细胞进展病毒的滴定2〕待测血清准备2.1 动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。

为排除这些不耐热的非特异性反响因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理各种不同来源的血清，须采用不同温度处理，猪、牛、猴、猫及小鼠血清为60℃；水牛、狗及地鼠血清为62℃；马兔血清为65℃；人和豚鼠血清为56℃加热时间为20-30min，60℃以上加热时，为防止蛋白质凝固，应先以生理盐水作适当稀释2.2取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，或者按1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280稀释，每个稀释度做3-4个平行孔3) 参加病毒,感作3.1以VGM将病毒稀释到100 TCID50/50μl (200 TCID50/100μ)3.2除细胞对照孔外每孔中参加与血清量相等的病毒液，在细胞对照孔中参加与血清量相等的VGM3.3 轻混病毒－血清混和物，37℃ 5％CO2培养箱中孵育2h4〕接种细胞4.1准备用于接种的刚到达完全融合的细胞的培养板，吸掉培养液，参加350μl无血清D-MEM培养液以洗掉剩下的FBS4.2 病毒－血清混和物孵育2h完毕后，各取100μl中和液到细胞培养板相应的孔中4.337℃ 5％CO2培养箱中孵育2h4.4 吸掉中和液，加250μl D-MEM 洗涤4.5 加200μl D-MEM 在37℃ 5％CO2培养箱中孵育3－4d，检测培养液中血凝活性，以能保护50％细胞培养管不被感染的最高血清稀释度的倒数作为中和终点。

在制备细胞悬液时，其浓度以在24h长满单层为度：血清病毒中和1h后取出，每孔参加100μl细胞悬液置5%CO2 37℃温箱培养，自培养48h开场逐日观察记录，14D终判由于各种病毒引起细胞病变时间不同，终判时间应根据病毒致细胞病变的快慢而定5〕对照组对照的设定：包括细胞对照〔培养液中仅含细胞，不含病毒和血清〕，阴性对照〔培养液中含有l00TCID50病毒、细胞及阴性血清〕和空白对照〔培养基中含有100TCID50病毒及细胞，不含血清〕，各设3个平行孔为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置以下对照，特别是在初次进展该种病毒的中和试验时，尤为重要阳性和阴性血清对照：阳性和阴性血清。