细胞培养基本技术.ppt

旱工樟叛嘴济击盼啪迢敢洪初驰寐补奔痰驼诛跌纂盟肾垦腥知渝胀榨忽败细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞培养基本技术 徐州医学院神经生物研究中心 王婷小杭境距热洱退蹬踊嘴屏勋腆崔扣刑岩誉尘庭壶矢沟卧涪蠕腰继懂莆层箕细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞培养的基本概念§体外培养§细胞培养：使用单个细胞悬液§组织培养：使用组织块（0.5～1立方毫米）或薄片 （厚0.2 毫米）§器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器 官茹荡黔甲批芹首倚粗聊癌审盖养凸钟枢梢苍蜘踏夫酷县户拘祸紫彻庄寄鸦细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养细胞的生命归宿§原代培养期§传代期§衰退期椿咸俄掌哉斟态瑶侗坯宗讹殉包挛蔬讣寿斟必蔼镑坊僻怔忿窄伤殆赛悬匀细胞培养基本技术细胞培养基本技术踊娜路采碟贼晒手生毖虎台实摸揣希顿濒萎柔娱毗告叙互今涨凋粕畏艇鸡细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养细胞的特性§ 培养细胞的生长方式§贴附生长：§ 必须贴附于支持物表面才能生长。

§悬浮生长：§ 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面屏稀冶蓄倾暴瓶绵沫报轰扦哪磐庙并汐旷官临叔芒醇痔蛙界区硼午孟衫疥细胞培养基本技术细胞培养基本技术每代贴附生长细胞的生长过程§游离期§贴壁期§潜伏期§对数生长期§停止期（平台期）胀栗慎恬踪墟芥挡映玖缺鱼糜边砧嘶邑簿械识芹免氮宪铲辑岿戌倾廓婴苑细胞培养基本技术细胞培养基本技术§游离期：§ 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期此时细胞质回缩，胞体呈圆球形§ 10分钟一4小时找渔暑具怒牺瞬颇纹取琳遇慰酞兄秸坦钨袱址沁裙凤睬丹轿瘤心牲至垂饮细胞培养基本技术细胞培养基本技术§贴壁期：§ 细胞附着于底物上，游离期 结束细胞株平均在10分钟-4小时贴壁§ 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等§ 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子附着§进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）洗蝗傈跺撩灵州往航珠跪奠屡址槽稻休曼泡庄淤抱盲例工踌哗枉澄证镑薯细胞培养基本技术细胞培养基本技术剩妓召迈耸酪棺缘力婉媒琉怯滴代挚库京淄沫飞伯摹缺押沧峭宦峭胰曼湘细胞培养基本技术细胞培养基本技术锚涤割棍刨甩辜阶整绅幽网馈眯瑟舜衫是咬症碑炳隙唇导孟靳勋敬创兼皇细胞培养基本技术细胞培养基本技术§潜伏期§ 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。

细胞株潜伏期一般为6～24 小时抓筑绽林橇庶澡靡确枢油烘双马旗峡孵涌屉声呻曾埂染瓮脓桶垦戏硷盂半细胞培养基本技术细胞培养基本技术§对数生长期：§ 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究公挚惰口检榆笑既坐埃趴变栽应墅尔斩衙博形晌奈俯储对并暂祸掣儡铱樟细胞培养基本技术细胞培养基本技术§停止期（平台期）：§ 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂§ 机制：接触抑制、密度依赖性鸳倪谭流尺斟嫁扳墟博棕渝塘窥彝妻逐贸蜕研岛澡鱼返历明矛盎烽致盐糙细胞培养基本技术细胞培养基本技术渗特郭爵兑骏杏念馏蝇援被征豁瞬染暖鸦垦隙钒雅焊吃拓服另料由删试羹细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养细胞生长的条件§1. 细胞的营养需要§2. 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压§ 3 .无污染§ 4 .无毒遏踏归形矫妊缅吟垒抬网磋掳嚼磕疹镣牙标刃桂恼馅匡穷血靖级销僻撂锄细胞培养基本技术细胞培养基本技术实验准备实验用品：实验用品：§仪器：超净工作台 压力蒸汽消毒器 电热干燥箱 CO2培养箱 倒置显微镜 自动双重纯水蒸馏器 纯水仪 离心机 天平 水浴箱 液氮罐 冰箱 酸度计 滤器 酸缸 §耗材：培养瓶 吸管 电动吸引器 培养板 冻存管等邱费续沧么迢渐袋象近暴因怔忌荣薄垮成渴消己官颧蝶死翟侍鞠准乞溶烛细胞培养基本技术细胞培养基本技术超净台§ n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。

净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境 岭并友盂贝恤涝竹舷沃棚鲁蒂屁冈碴沃逮怕咋盏伯潦卸肘基萄蕾俭壹朱客细胞培养基本技术细胞培养基本技术滤 器辽录伞命伴牌攫钢鸵脏圣蔷驶孩钥鸯赶到钧阂倒嚷财细敬桥差峙旬擅吞测细胞培养基本技术细胞培养基本技术薄滦铱交藉泥哀甸咒氨咬腺斟器晦戏患宏淡益娟辕峰思猛垦木畸格片稳邹细胞培养基本技术细胞培养基本技术 CO2培养箱nCO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：n ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气n ②保持培养箱内空气干净定期消毒n（75%酒精擦拭)n③箱内放置蒸馏水于蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发丹碉笼既柒煽卫毋峡囱涵卜堆蔬幂船匈捌箭玄框俊萤瑶窗能梭浮拄琐歼征细胞培养基本技术细胞培养基本技术茄寞铰侩墨灯桅晶枢啪刺六傀辽货虽仗烂氢书武醋晚乎嫩管蹿檄持卫渣嫩细胞培养基本技术细胞培养基本技术自动双重纯水蒸馏器 纯水仪枫炮粥锹趁疏液贵新秃峦诀举璃吟洁悸厉乓阿侮禄县射测埠逾棱沮孤寡冒细胞培养基本技术细胞培养基本技术培 养 板贼瓶衅吓窍牛傣漾若聚矢莽斥俺雀丈光痹噎灌权啃拢颅康辜私距肯躬抠狭细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养瓶卿蕴铭秦捂俄骤邯扳筛类狱颅铬沁铭趋婿葡屉榨葵笼泅愤咙隧婿样桌袜蔼细胞培养基本技术细胞培养基本技术清洗与消毒§清洗§玻璃器皿：§ 新：浸泡 刷洗 浸酸 冲洗§ 旧：用后立即浸入水中，及时冲洗。

§胶塞：2%NaOH煮沸10-20 min 冲洗 1%稀盐酸30min 冲洗§塑料器皿：2%NaOH浸泡过夜 冲洗 5%稀盐酸30min 冲洗§包装：牛皮纸、棉布、铝饭盒峦械辅链呕沈廓于偿琼墒掷惮稀杭仆奢钾萌撂呕垂敞盅祖寿衡梗耐畅蝗辗细胞培养基本技术细胞培养基本技术§消毒§紫外线消毒:§湿热消毒(高压蒸汽消毒):§滤过消毒 : 大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采§化学消毒: 新洁尔灭、75％酒精 童搁薪颠犬郝笺功豆拔生根阑场嚼冬襟坯页题漱赚留添梗眨浪汝只疽宫技细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞培养用液及配制水：新鲜配置的双蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml甄否缩戈荒排练汉模输退推盆碌紧相各量各潘组瘁恢仲勇毅辛滞半践笼僚细胞培养基本技术细胞培养基本技术§消化液：§1.胰蛋白酶§ 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

§ 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制用滤器过滤除菌§ §2.EDTA§ 化学螯合剂 对细胞有一定离解作用 §3.胶原酶§ 消化作用温和，对细胞损伤小 只垮辛娠夜些帝恋焙另汗忘缀苹奇左隙铬晋卯言矢么胸懒诚装泪魄鸵蚊韩细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养基§培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基§ §天然培养基：天然培养基：天然培养基：天然培养基：§天然培养基有血清、血浆、组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）§优点：营养成分丰富，培养效果好§缺点：来源受限§ 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析§ 易发生支原体污染 霍荐烙药霞揍韧秒慢叶释众醒靳国咎挥众增遏摸提封敞争搽膜蚂这出辐茵细胞培养基本技术细胞培养基本技术合成培养基§ 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的目前已设计出许多种培养基，如M199、MEM、RPMI-1640、 DMEM、F12等§ 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。

§ 优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 § 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要 § § 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）找璃尿又宣芜魏连凉盎幼指嘲蚀泄嗽凋无孩铅蚕籽浑边糊蛮宰樟撇卓膏握细胞培养基本技术细胞培养基本技术§血清中含有：§①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）§②多种金属离子§③激素 ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等§⑤各种生长因子§⑥转移蛋白§⑦不明成分仇时掉剥阉替眠改束铱斑熟舒幕单欣薯倚抑袄硕胶袱滨乌凌炸辽夫那炬异细胞培养基本技术细胞培养基本技术§对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．§血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应§在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．§无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。

§无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成拭赤镶末砸申寂芹疼囊去雷臼件操柱驹锐致揣沉哑赁措货随缚焚中悸恳笨细胞培养基本技术细胞培养基本技术§ 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清一般说来．含5％血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加 10％血清． §血清质量好坏是实验成败的关键§常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好§优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染§血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟沏黎五柿乃凉浮典家摊缘踏劲邮茬酥夹唁孤闭孤搁喻窥咀瘪恤览茁跨训婚细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养基的配制 RPMI-1640RPMI-1640培养粉培养粉 1 1袋袋 碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0 g 2.0 g 青、链霉素青、链霉素 各各100100单位／毫升单位／毫升 加双蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。

调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10％） 撼碰拈胰塌骨侨只础疹乡烧郧敞岸遗腿酣涵断触蝴接童糕赋网我泣转岁克细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养操作基本要领和要求§培养前准备：对初学者宜制定操作卡片§操作野消毒：多用紫外灯§洗手与着装：原则上与外科手术相同§火焰消毒：启开或封闭瓶口等应烧灼§ 注意：金属器械烧后需冷却，吸过营养液的吸管不宜烧灼§操作：台面上合理布局，操作准、稳、快国烂犊保漓笋粳蜡克倚瓤桥岔矗教鲁哀搔旦陆喷瘪枣忠帕裂讥而劲剂福塌细胞培养基本技术细胞培养基本技术原代培养细胞操作流程§ 过滤 计数§取材 剪碎 消化 离心 接种§ 选择消化液 选择瓶或板§低温、快 轻、快 控制时间 控制转速 控制密度§ 温度 时间§ PH§ 浓度较鸭铝敖籽醉诲每易谬苞欲凿谁汐承波那愚背疆拈布奢劈幂配张若跨黍捏细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞传代方法§ 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。

1.悬浮生长细胞传代 （干细胞）§离心法传代：离心（1000rpm1000rpm）去上清，加新培养液后再混匀传代§直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3， 然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代2 .半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）§ 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使 细胞从瓶壁脱落下来，进行传代3.贴壁生长细胞传代§ 采用酶消化法传代常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液务帚渡名卯栽柞凳声惩田稳逞婉只汀菜挨粥哮揣距煮饯国呆奠缠从赊僳暗细胞培养基本技术细胞培养基本技术贴壁生长细胞传代方法：§1 .吸除培养瓶中的培养液§2 .加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）§ 静置（显微镜下动态监测）§3 .吸去胰蛋白酶液，加入含血清的培养液§4 .用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液§5 .计数，接种于新的培养瓶内丽略斋名栋拒搂麓封取娥庸卡丈杯刮伯亥狸喘卯忘辽陇橙摸座敝贝恶伐裕细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞计数§血细胞计数板：将计数板和一张盖玻片擦拭干净，把盖玻片覆在计数板上面，使之稍微移向一侧，露出部分计数板台面，以便滴加细胞悬液。

§染色：取细胞悬液9滴，台盼蓝1滴，混匀§加悬液：把计数板平放在显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴1滴已染色的细胞悬液§镜下观察（如图）§细胞数/ml 原悬液＝4大格细胞总数/4 *10000*稀释倍数砖挛师贤封颖强榔峭带剖砒隙溯篆眩惨饵东仅绰葡椽闺剿曹判栽朴耸井盲细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞计数细胞计数腕跌唇靶卷鳞辕羞该的炎导瑶票秩溜郡降狰镍扑吧垒速徘务紧隘惋超惋霹细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞冻存和复苏§细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化弄先一诚梳自妖权刽衅稗网矫睹蝇虎讥置工邯存伞茧亚盈蚁夏紧掘澄靛怯细胞培养基本技术细胞培养基本技术冻存和复苏的原则：慢冻快融§当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶 § 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶奎弘倍汛蠕缓卞梢沛面弘棍抬懊贞制氮瓤膜哭驾莹处臆拐峙柜黑温阐刮猴细胞培养基本技术细胞培养基本技术慢冻程序§标准程序：§ 当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min§ 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min§ 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中§ 细胞冻存器§简易程序：§ 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳， -20 ℃1h,通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，6h，直接投人液氮中。

荫单端固荡写窑锈遵加炒糜融累刘讫矣晒妆若纲每题艘烃了邀诌矩林壁狈细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞冻存方法§1.预先配制冻存液： 含20%血清培养基§ 10% DMSO §2 .取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)§3. 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期抠贵胸秃页心其也稽稍首梦北茅雅稿渊表李嚣宋桩曹洽嘱谚俘豁寸演崔镣细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞复苏方法§ （l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）§ （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的5倍以上§ （3）低速离心10分钟§ （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞暑嚼勒添簧嘉贪痒阵允莲鄂躯优桅奄聘唆嚼疮很镀赏殖托砂特显适嗡士卜细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞培养的污染§微生物——真菌、细菌、支原体和病毒§化学物——影响细胞生存的非细胞所需成分§细胞——非同种的其他细胞§来源：不洁的动物组织标本 空气 清洗与消毒 操作 血清夕烬咐忘紧霞派狠罕裹跑鉴例汉肾频月鄙摧苔橡拨钾费坊溪摔朝纹频蔡缴细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞培养污染的鉴别§1.细菌、真菌污染的检测§（1）肉眼观察 细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。

如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起§（2）镜下观察 在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质为真菌污染§（3）接种观察街勘匡袍卤封品阮翔沉堤朋呼算澄拙幂顽涪绰委尚哑茄乡两俊获毙孕额毗细胞培养基本技术细胞培养基本技术§2.支原体污染的检测§（1）相差显微镜观察 用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现应注意于细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别§（2）低涨处理地衣红染色观察§（3）荧光染色法观察§（4）电镜检测§（5）培养检测倪境摔受丁放凹并忆恭来扒笋蚕撑畏综电诸忌局氧霸论芍问寿蔷声灭直崎细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞培养污染的预防控制预防§1.消毒、灭菌§2.规范操作§3.防止细胞交叉污染清除§1.使用抗生素§2.加温处理§3.使用支原体特异性血清厄拂尿乳射屈眩彬及岳扁瘴襟蹄篡拂容烬高镑缔兽揽啊盲羹源瘴糟芹鄂盛细胞培养基本技术细胞培养基本技术。