免疫细胞的分离和功能测定--课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,免疫细胞的分离与功能测定,,,免疫细胞的分离与功能测定,1,一 外周血单个核细胞的分离,原理: 密度梯度离心，,利用密度为1.077±0.001g/L 淋巴细胞分层液（聚蔗糖-泛影葡胺）,,,,,一 外周血单个核细胞的分离原理: 密度梯度离心，,2,精品资料,精品资料,3,,你怎么称呼老师？,如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？,你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？,教师的教鞭,“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……”,“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”,免疫细胞的分离和功能测定--课件,4,,,免疫细胞的分离和功能测定--课件,5,主要步骤,1 无菌采集静脉血，抗凝（每1ml全血加0.1ml 125～250U /ml 肝素溶液）,2 用等体积Hanks平衡盐溶液(HBSS)或pH7.2～7.4 PBS 稀释,3 按每10ml稀释血用3～5ml淋巴细胞分层液的比例先将淋巴细胞分层液加入离心管中，再小心沿管壁缓慢加入稀释血，注意切勿使血液混入分层液,4 2000r/min 水平离心30min，,5 吸取分层液与血浆交界部位的单个核细胞，用5倍体积的HBSS或RPMI-1640洗涤2次依次以2000 r/min，1500 r/min离心10min,6 用完全RPMI-1640定容，计数。

一般每ml健康成人血可分离出1×10,6,～2×10,6,单个核细胞,7 台盼蓝染色，检查细胞活性，活细胞应﹥95﹪主要步骤,6,注意事项,1 严格无菌操作,2 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀,3 淋巴细胞分层液应4℃避光保存，取出后待温度升至室温使用,4 如须保存血浆作他用，则不能稀释血液,5 离心最适温度18～20℃,6 分离组织中的单个核细胞也可采用上法,,,注意事项,7,二 淋巴细胞的纯化,,㈠红细胞的去除,1 低渗裂解法,1ml蒸溜水加入沉淀的PBMC中，轻摇（﹤1min）,立即加入1.8﹪NaCl, 洗涤,2 氯化铵处理法,沉淀的PBMC中加入1ml 0.83﹪氯化铵溶液，轻摇2 min，洗涤,,,二 淋巴细胞的纯化,8,㈡血小板的去除,1 .PBMC经洗涤2～3次可去除大部分血小板,2 .胎牛血清(FCS)梯度离心,1ml PBMC悬液（1×107～2×107/ml）用3ml FCS,800r/min 水平离心15min，18～20℃,,,㈡血小板的去除,9,㈢单核细胞的去除,1 .粘附去除法,,,,㈢单核细胞的去除1 .粘附去除法,10,原理 单核细胞可粘附在玻璃或塑料表面,⑴PBMC用完全RPMI-1640调整浓度至2×106/ml ⑵将50ml细胞悬液移入150cm2培养瓶，37℃ 5﹪CO2 95﹪湿度培养1h,⑶收集非粘附细胞，再用预温至37℃的RPMI-1640 ,轻轻荡洗培养瓶并收集荡洗液,⑷1300r/min 离心10 min，18～20℃,⑸弃上清，用5～10ml完全RPMI-1640悬浮细胞计数，用台盼蓝染色检查细胞活性,,,原理 单核细胞可粘附在玻璃或塑料表面,11,2. L-亮氨酸甲酯去除法,溶酶体酶→L-亮氨酸甲酯,→L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯,此法也可清楚NK细胞和细胞毒性T细胞,本法只适用于分离新鲜细胞,,,2. L-亮氨酸甲酯去除法,12,⑴用PBS调整细胞浓度至3×10,6,5×10,6,/ml，用无血清RPMI-1640配制10mmol/L的L-亮氨酸甲酯溶液（临用时配），两液按1︰1比例混合，室温40min,⑵1300r/min 离心10 min，用HBSS或PBS洗涤沉淀共3次,⑶用完全RPMI-1640悬浮细胞，用无菌尼龙网过滤，离心并计数，调整细胞至所需浓度,,,⑴用PBS调整细胞浓度至3×1065×106/ml，用无血清,13,3. 羰基铁吞噬离心法,,,,3. 羰基铁吞噬离心法,14,在抗凝血中加入一定量羰基铁粉，37℃搅拌15 min，然后用淋巴细胞分层液离心分离,亦可先分离PBMC，再加羰基铁粉分离去除单核细胞,粘附法去除单核细胞后，大约95﹪为淋巴细胞，活性＞95﹪,L-亮氨酸甲酯法，99﹪为淋巴细胞，活性＞95﹪,,,,在抗凝血中加入一定量羰基铁粉，37℃搅拌15 min，然后用,15,三 外周血淋巴细胞选择性分离,,㈠ T细胞的分离,1 .尼龙棉柱法,原理,B细胞易粘附于尼龙棉纤维，而T细胞则否,,,,三 外周血淋巴细胞选择性分离 ㈠ T细胞的分离,16,尼龙棉（聚酰胺纤维）预处理,尼龙棉（聚酰胺纤维）50mg在0.2mol/L HCl浸泡过夜，用大量蒸溜水漂洗，晾干。

尼龙棉柱制备,塑料软管 长12～16cm 内经5～6mm 壁厚0.2 mm高6cm的尼龙棉柱可有效地滤过20×10,6,～30×10,6,个细胞.此法分离的T细胞纯度可达90﹪以上,,,尼龙棉（聚酰胺纤维）预处理,17,2 .花环形成分离法,原理 T细胞表面有绵羊红细胞受体，可与绵羊红细 胞结合形成花环.,绵羊红细胞用2-氨基乙基异硫脲溴化物（AET）或神经氨酸酶（NM）可提高花环形成的效果和稳定性,,,2 .花环形成分离法,18,,,免疫细胞的分离和功能测定--课件,19,⑴1ml PBMC悬液(1×10,7,/ml)、2ml NCS和 1ml 4﹪AET-SRBC悬液混匀，37℃水浴10 min,↓,800r/min 4℃离心5 min，冰浴1h 或,800r/min 室温离心10 min，4℃2h,↓,置淋巴细胞分层液（3～5ml分层液可分离10mlPBMC/NCS/AET-SRBC混合液）,↓,1300r/min 离心25 min，18～20℃ 或,2000r/min 离心35 min，4℃,位于界面的是非花环形成细胞，沉淀的是花环形成细胞,,,⑴1ml PBMC悬液(1×107/ml)、2ml NCS和,20,⑵1ml PBMC悬液(1×107/ml)、2ml NCS和 2ml 2﹪NM-SRBC悬液混匀，37℃水浴10 min,以下步骤同⑴,经1次花环形成试验所得到的花环形成细胞中，T细胞﹥95﹪，B细胞﹤1﹪，单核细胞约为2﹪。

经2次花环形成试验后，非花环形成细胞中T细胞﹤2﹪,用此法时，因SRBC与受体结合可激活某些T细胞，导致功能增强,,,⑵1ml PBMC悬液(1×107/ml)、2ml NCS和,21,㈡ T细胞亚群的分离,1. 间接免疫吸附分离法,,原理,T细胞 + 抗某种T细胞分化抗原的抗体,↓,加入包被有羊抗鼠Ig的平皿,,,㈡ T细胞亚群的分离,22,2 .抗体/补体介导的细胞毒作用分离法,,原理,是一种负性分离法,T细胞 + 抗某种需去除T细胞分化抗原的抗体+补体→该亚群T细胞裂解,如 T细胞 + 抗CD4抗体 + 补体→CD4+细胞裂解,T细胞 + 抗CD8抗体 + 补体→CD8+细胞裂解,,,,2 .抗体/补体介导的细胞毒作用分离法,23,3.免疫磁性微珠分离法,,原理,羊抗鼠Ig + 磁性微珠→免疫磁性微珠,T细胞 + 抗某种亚群分化抗原的抗体,↓,加免疫磁性微珠,↓,在外加磁场作用下，该亚群T细胞连同免疫磁性微珠一起沉降,,,3.免疫磁性微珠分离法,24,,如 T细胞 + 抗CD4抗体,↓,加免疫磁性微珠,↓,在外加磁场作用下，CD4,+,T细胞连同免疫磁性微珠一起沉降，CD8,+,T细胞则留在悬液中,,优点,细胞纯度高，产量大，操作简单,,,如 T细胞 + 抗CD4抗体,25,㈢ B细胞的分离,1 .负性B细胞分离法,⑴用密度梯度离心法分离PBMC,⑵用L-亮氨酸甲酯法去除单核细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞,⑶用花环形成法去除T细胞,用此法分离B细胞，240ml 全血中可得1×10,7,～2×10,7,个B细胞，纯度﹥90﹪，2﹪～3﹪的单核细胞，﹤1﹪的其他细胞,,,㈢ B细胞的分离,26,2 .直接免疫吸附法,兔抗人Ig包被平皿,↓,淋巴细胞悬液,↓,洗去未吸附细胞，收集吸附细胞,,,2 .直接免疫吸附法,27,3.间接免疫吸附法,淋巴细胞悬液 + 抗CD19、抗CD20抗体,↓,羊抗鼠Ig包被的平皿,↓,洗去未吸附细胞，收集吸附细胞,4.免疫磁性微珠分离法,,,,3.间接免疫吸附法,28,㈣ NK细胞的分离,1.负性NK细胞分离法,⑴用密度梯度离心法分离PBMC,⑵用粘附法去除单核细胞,⑶用尼龙棉柱法去除B细胞,⑷用花环形成法去除T细胞,2 .免疫磁性微珠分离法，抗CD16抗体,,,㈣ NK细胞的分离,29,四 淋巴细胞亚群的检测,,㈠ 免疫荧光技术,直接法 FITC-抗CD4抗体,FITC-抗CD8抗体,间接法 FITC-羊抗鼠Ig,抗CD4抗体,抗CD8抗体,,,,四 淋巴细胞亚群的检测,30,㈡ 微量细胞毒试验,PBMC + 抗某亚群T细胞分化抗原的抗体+补体,↓,加染料，该某亚群T细胞着色,如 T细胞 +抗CD4抗体+补体,↓,加伊红染料，呈红色的为CD4+细胞,,,㈡ 微量细胞毒试验,31,㈢花环技术,1葡萄球菌花环法,原理 SPA可与IgGFc段结合,直接SPA菌花环法,SPA菌-抗CD3、SPA菌-抗CD4、SPA菌-抗CD8,间接SPA菌花环法,SPA菌-兔抗鼠Ig（IgG类）,抗CD3、抗CD4、抗CD8,,,㈢花环技术,32,2 红细胞花环法,原理 将SRBC与mAb或兔抗鼠IgG偶联,直接红细胞花环法,SRBC-抗CD3、SRBC-抗CD4、SRBC-抗CD8分别与去除粘附细胞的PBMC作用，染色后镜检200个淋巴细胞，计算花环形成细胞百分率,,,,2 红细胞花环法,33,间接红细胞花环法,抗CD3、抗CD4、抗CD8分别与去除粘附细胞的PBMC作用，加入SRBC-兔抗鼠IgG偶联物作用，染色后镜检200个淋巴细胞，计算花环形成细胞百分率,,,间接红细胞花环法,34,五 淋巴细胞功能测定,,㈠ 淋巴细胞增殖试验,非特异性刺激物,PHA、ConA、PWM、SPA、LPS，胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白质，抗CD2、抗CD3、抗IgM等细胞表面标志的抗体，及某些细胞因子,特异性刺激物,特异性抗原,,,,五 淋巴细胞功能测定,35,1 .丝裂原刺激的淋巴细胞增殖试验,丝裂原→淋巴细胞→淋巴母细胞,⑴,3,H-TdR掺入试验,SI﹦试验组cpm/对照组cpm,,,1 .丝裂原刺激的淋巴细胞增殖试验,36,⑵ 形态学方法,结果以淋巴细胞转化率表示,⑶ MTT比色法,琥珀酸脱氢酶→MTT→甲,月赞,+盐酸异丙醇或二甲基亚砜→溶解后测OD值,SI﹦试验组OD均值/对照组OD均值,,,⑵ 形态学方法,37,2 .混合淋巴细胞培养,单向混合淋巴细胞培养,双向混合淋巴细胞培养,可分3H-TdR掺入法、形态学方法及MTT比色法,,,2 .混合淋巴细胞培养,38,3 .自身混合淋巴细胞反应,4 .淋巴因子诱导的细胞增殖反应,如 IL-4→B细胞，IL-2→T细胞,,,3 .自身混合淋巴细胞反应,39,5 .影响细胞增殖反应的因素,⑴细胞应保持高活性，,⑵可溶性抗原刺激淋巴细胞增殖时，常需一定数量的抗原呈递细胞,⑶不同的刺激原有不同的刺激剂量,⑷严格无菌操作,,,5 .影响细胞增殖反应的因素,40,六 NK细胞活性测定,,靶细胞 人NK细胞 K562细胞（靶细胞）,鼠NK细胞 YAC-1细胞（靶细胞）,,,六 NK细胞活性测定,41,㈠ 形态学方法,原理 靶细胞被NK细胞杀伤后细胞膜通透性改变而使台盼蓝染料透入细胞，细胞呈蓝色，无折光性,,,,㈠ 形态学方法,42,靶细胞 K562细胞或YAC-1细胞用完全RPMI-1640,调整细胞浓度为2×10,5,/ml,效应细胞 人PBMC或小鼠脾细胞用含15﹪NCS的RPMI-1640调整细胞浓度为1×10,7,/ml,对照孔 100ul靶细胞＋100ul完全RPMI-1640,实验孔 100ul靶细胞＋100ul效应细胞,效/靶细胞比例（E/T ）为50︰1,各设3个平行空，37℃ 5﹪CO2温箱培养过夜,每孔各取30ul细胞悬液，加30ul 0.5﹪台盼蓝室,温染色5min,,,靶细胞 K562细胞或YAC-1细胞用完全RPMI-164,43,于白细胞计数板中每孔各计数100个细胞，记录死,细胞及活细胞数，求出各组NK细胞活性的均值,,,实验组靶细胞死亡数－对照组靶细胞死亡数,NK细胞活性%﹦ 100 100﹪,,×,,,于白细胞计数板中每孔各计数100个细胞，记录死×,44,㈡ 同位素释放法,1 .,51,Cr释放试验,2.,125,I-UdR释放试验,3. 全血NK细胞活性同位素检测法,,,㈡ 同位素释放法,45,七 单核-巨噬细胞的分离与功能测定,,㈠人单核细胞的分离方法,单核细胞占外周血白细胞的3﹪～5﹪,,,七 单核-巨噬细胞的分离与功能测定,46,1 Peroll离心沉淀法,Peroll（聚乙烯吡咯酮包被的硅胶混悬液）,Peroll连续密度梯度液配制,Peroll 7ml 和2×PBS 6ml→1500r/min 离心40min,操作步骤,PBMC加到3～5mlNCS上,↓,800r/min，离心15 min（18～20℃）,↓,沉淀细胞用含10﹪NCS的PBS配制成2×10,7,～5×10,7,/ml悬液,↓,加到Peroll连续密度梯度液，4℃ 2400 r/min 离心20 min,↓,出现4个细胞层，吸取第二层细胞（单核细胞占70﹪～90﹪），洗涤后计数，配制成所需浓度,,,1 Peroll离心沉淀法,47,2 粘附法,用EDTA抗凝血制备PBMC，用DEME液将PBMC配制成2×106/ml悬液，加入培养瓶（75cm2瓶加10 ml细胞悬液）,↓,37℃ 5﹪CO2 温箱 1h,↓,用DEME液洗涤2次，洗去非粘附细胞,↓,用细胞刮片刮下细胞，或加入0.2﹪EDTA/PBS，,10min 后收集细胞，,↓,1500 r/min 离心10 min, 配制细胞悬液，计数并调整至所需浓度,,,2 粘附法,48,,,免疫细胞的分离和功能测定--课件,49,3 Colotta法,用PBS5倍稀释的肝素抗凝血20ml，加在20ml淋巴细胞分层液上,↓,2000 r/min 离心20 min 室温,吸取PBMC用PBS洗涤两次，500 r/min 离心10 min,↓,弃上清，沉淀中加入5ml含10﹪NCS，25mmol/L HEPES的RPMI-1640培养液,↓,加在5ml 46﹪Percoll液中,↓,2200 r/min 离心30 min 室温，得到3个带，第一,带为富含单核细胞层（83﹪），第二带含少量单核细胞，第三带为淋巴细胞,↓,吸出，洗涤，计数并调整至所需浓度,,,3 Colotta法,50,㈡ 单核-巨噬细胞功能测定,1 单核-巨噬细胞趋化试验,2 巨噬细胞吞噬功能测定,,,㈡ 单核-巨噬细胞功能测定,51,⑴人体巨噬细胞的获取,①用1cm2大小滤纸蘸满10﹪斑蝥酊置于前臂皮肤,②4～5h后可见局部皮肤发红,③48h后局部形成水疱,④无菌吸取水疱液,一般可吸1～2ml,最多可吸8ml, 巨噬细胞平均为30﹪～40﹪,最多可达80﹪,⑵ 鸡红细胞悬液制备,阿氏液抗凝鸡血,洗涤3次后配成5﹪CRBC悬液,,,⑴人体巨噬细胞的获取,52,⑶吞噬试验,皮泡液0.5ml＋5﹪CRBC悬液0.01ml,↓,37℃水浴30min,每10min轻摇1次,↓,1000r/min 离心5min,,↓,细胞用甲醇固定,Giemsa染色,↓,油镜观察100～200个巨噬细胞,计算吞噬率及吞噬指数,,,⑶吞噬试验,53,吞噬率 每100个巨噬细胞中有吞噬CRBC的细胞数,吞噬指数 将100个巨噬细胞吞噬的CRBC总数除以100,,,吞噬率 每100个巨噬细胞中有吞噬CRBC的细胞数,54,在计数时应同时注意CRBC被消化的程度,Ⅰ级 未消化 胞质浅红或浅黄带绿色,胞核浅紫红色,Ⅱ级 轻度消化 胞质浅黄绿色,核固缩呈紫蓝色,Ⅲ级 重度消化 胞质淡染,核呈浅灰黄色,Ⅳ级 完全消化 巨噬细胞内只见形状似CRBC大小的空泡,边缘整齐,胞核隐约可见,,,,在计数时应同时注意CRBC被消化的程度,55,。