《人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中氨基酸检测方法》征求意见稿.doc

ICS11.040.30C 30YY中华人民共和国医药行业标准YY/T XXXXX—XXXX人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中氨基酸检测方法 Medical devices for human assisted reproductive technology—The test method for amino acids in human assisted reproductive medium（征求意见稿）XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施国家药品监督管理局发布YY/T XXXXX—XXXX目次前言 II1 范围 12 规范性引用文件 13 术语、定义 14 方法一：氨基酸分析仪测定氨基酸含量 225 方法二：高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪测定氨基酸含量 36 方法三：高效液相色谱衍生法测定氨基酸 7前言本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由国家药品监督管理局提出本标准由中国食品药品检定研究院归口本标准起草单位： 本标准主要起草人： 9人类辅助生殖技术用医疗器械 培养用液中氨基酸检测方法1　 范围本标准规定了用本标准规定了氨基酸分析仪、高效液相色谱、高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪检测人类辅助生殖技术用液中氨基酸成分。

本标准适用于人类辅助生殖技术用液中所含甘氨酸（GLY）、亮氨酸（LEU）、蛋氨酸（MET）、酪氨酸（TYR）、组氨酸（HIS）、苏氨酸（THR）、丙氨酸（ALA）、异亮氨酸（ILE）、色氨酸（TRY）、胱氨酸（CYS）、赖氨酸（LYS）、天门冬氨酸（ASP）、缬氨酸（VAL）、苯丙氨酸（PHE）、脯氨酸（PRO）、丝氨酸（SER）、谷氨酸（GLU）、精氨酸（ARG）、牛磺酸（TAU）19种氨基酸的定量分析2　 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件JJG 1064—2011 氨基酸分析仪检定规程YY/T 0995-2015 人类辅助生殖技术用医疗器械 术语和定义3　 术语、定义YY/T 0995-2015界定的以及下列术语和定义适用于本标准3.1　高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪 high-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry, LC-MS/MS高效液相色谱将样品中的待测成分初步分离开，三重四级杆质谱仪对分开的待测成分通过筛选母离子质核比得到待测离子，待测离子经碰撞后碎裂成子离子，最后通过子离子的碎片强度定量待测成分。

3.2　氨基酸分析仪 amino acid analyzer，AAA氨基酸分析仪中离子交换色谱柱将样品中不同的氨基酸分离，并以茚三酮做柱后衍生后，在570nm和440nm波长下测定，以外标法进行定量3.3　高效液相色谱柱前衍生法 (HPLC pre-column derivatization and analysis method) 待测组分先通过衍生化反应，转化为衍生化产物，然后再经过色谱柱进行分离高效液相色谱法中柱前衍生的目的是:通过衍生化反应，使原来不能直接被检测的组分转化为能被所用检测器检测的物质;使被测组分与衍生化试剂有选择地参加反应，而与样品中的其他组分分离;改变被测组分在色谱柱的出峰次序，使之更有利于分离4　 方法一：氨基酸分析仪测定氨基酸含量4.1　 原理不同氨基酸有不同的色谱表现，通过氨基酸分析仪的离子交换色谱法柱分离后，以茚三酮做柱后衍生后进行测定，以外标法定量4.2　 试剂除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682中规定的一级水4.2.1　 不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸锂缓冲液：按仪器使用说明书配制或购买4.2.2　 茚三酮溶液：按仪器使用说明书配制或购买。

4.2.3　 4%磺基水杨酸溶液：称取磺基水杨酸4 g，加水稀释至100 mL4.2.4　 19种氨基酸对照品：可采用有证标准品4.3　 对照品溶液配制4.3.1　 氨基酸对照品储备液分别取氨基酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度，制成氨基酸对照品储备液称取L-色氨酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加少许水和数滴0.1 mol/L氢氧化钠，使之溶解，加水定容至刻度4.3.2　 混合氨基酸对照品系列溶液移取单个氨基酸对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，加水稀释配制成混合氨基酸对照品储备液将混合氨基酸对照品储备液稀释，配制成混合氨基酸对照品系列溶液使各氨基酸浓度在10 nmol/mL~1000 nmol/mL范围4℃冰箱保存一周4.4　 仪器4.4.1　 电子天平，精度为0.000 1g4.4.2　 氨基酸分析仪茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪，要求各氨基酸的分辨率大于90%4.4.3　 高速离心机4.4.4　 旋涡振荡器4.5　 试样制备精密移取一定量样品，加水稀释至各氨基酸浓度在10 nmol/mL~1000 nmol/mL范围样品中如含有蛋白，取样品0.5 mL，加0.5 mL 4%磺基水杨酸，混匀后，15 000 r/min离心10 min，取上清液备用。

当上清液中各氨基酸浓度不在10 nmol/mL~1000 nmol/mL范围，应用水适当稀释4.6　 分析步骤4.6.1　 仪器调试使用混合氨基酸对照品系列溶液注入氨基酸分析仪，参照JJG1064—2011氨基酸分析仪检定规程及仪器说明书,适当调整仪器操作程序及参数和洗脱用缓冲溶液试剂配比,确认仪器操作条件4.6.2　 测试在上述测试条件下，取混合氨基酸对照品系列溶液和样品溶液（或供试液）20 μL，分别注入氨基酸分析仪, 以各氨基酸对照品峰面积为纵坐标，氨基酸对照品浓度为横坐标，绘制各氨基酸标准曲线，计算回归方程4.7　 结果与计算4.7.1　 样品中各氨基酸含量样品中各氨基酸含量按公式（1）计算 式中：Ci ----- 根据回归方程计算样品测定液中氨基酸i含量，nmol/mL; Xi----- 样品中氨基酸i含量, nmol/mL; K----- 试样稀释倍数4.7.2　 结果表示以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果，保留两位小数4.7.3　 平行样测试每个样品需做平行双样，平行双样测定结果的相对偏差应≤20%。

5　 方法二：高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪测定氨基酸含量5.1　 原理通过乙腈沉淀辅助生殖用培养液中的蛋白质，离心取得上清液后，通过高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪分离检测，根据保留时间及特征离子质核比定性，外标法定量5.2　 试剂除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682中规定的一级水5.2.1　 乙腈，色谱纯5.2.2　 甲酸，色谱纯5.2.3　 19种氨基酸对照品可采用有证标准品5.3　 氨基酸对照品溶液配制5.3.1　 氨基酸对照品储备液分别取氨基酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度，制成氨基酸对照品储备液称取L-色氨酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加少许水和数滴0.1 mol/L氢氧化钠，使之溶解，加水定容至刻度5.3.2　 混合氨基酸对照品系列溶液移取单个氨基酸对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，加水稀释配制成混合氨基酸对照品储备液将混合氨基酸对照品储备液稀释，配制成混合氨基酸对照品系列溶液使各氨基酸浓度在0.05 nmol/mL~10.00 nmol/mL范围5.4　 仪器5.4.1　 高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪，配电喷雾离子化源（ESI）。

5.4.2　 电子天平，精度为0.000 1g5.4.3　 高速离心机5.4.4　 涡旋振荡器5.5　 试样制备精密移取一定量样品，加水稀释至各氨基酸浓度在0.05 nmol/mL~10.00 nmol/mL范围样品中如含有蛋白，取样品100μL，加200 μL乙腈，涡旋混匀后，15 000 r/min离心1min，取上清液备用当上清液中各氨基酸浓度不在0.05 nmol/mL~10.00 nmol/mL范围，应用水适当稀释5.6　 分析步骤5.6.1　 仪器参考条件5.6.1.1　 高效液相色谱仪参考条件色谱柱：填料为3μm五氟苯基柱，柱长150 mm，内径2.1 mm的色谱柱或其他性能相似的色谱柱；流动相：A为100%水（含0.1%甲酸溶液）；B 为100%乙腈(含0.1%甲酸溶液)；流速：0.35 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：1.0 μL；梯度洗脱程序见表1表1 流动相梯度洗脱程序 时间(min )流动相B比例(%)1.403.5257.5358.09511.09511.5014停止5.6.1.2　 质谱仪参考条件离子源：电喷雾离子源；离子检测方式：多反应监测；离子源接口电压：-3.0 kV；雾化气：氮气，3.0 L/min；干燥气：氮气，10 L/min；加热气：空气，10 L/min；碰撞气：氩气；脱溶剂管温度：250 ℃；加热模块温度：400 ℃；接口温度：300 ℃；19种氨基酸的质谱分析条件参数见表2。

表2 19种氨基酸的质谱分析参数 成分定量离子(m/z)离子极性Q1 Prerod bias(V)CE(V)Q3 Prerod bias(V)甘氨酸（Glycine）75.90>30.15正离子-17.0-11.0-30.0丙氨酸（Alanine）89.90>44.10正离子-22.0-12.0-18.0脯氨酸（Proline）116.0>70.15正离子-30.0-18.0-14.0丝氨酸（Serine）105.90>60.10正离子-25.0-12.0-11.0缬氨酸（Valine）118.00>57.10正离子-12.0-30.0-23.0苏氨酸（Threonine）120.10>74.15正离子-27.0-13.0-14.0亮氨酸（Leucine）132.10>30.05正离子-30.0-18.0-29.0异亮氨酸（Isoleucine）132.10>69.15正离子-30.0-19.0-14.0天冬氨酸（Aspartic acid）134.00>74.05正离子-30.0-15.0-14.0赖氨酸（Lysine）147.20>130.10正离子-15.0-16.0-25.0谷氨酸（Gluta。