细胞融合及其应用课件.ppt

第四章第四章 细胞融合及其应用细胞融合及其应用第一节第一节 细胞融合概述细胞融合概述第二节第二节 细胞融合技术应用细胞融合技术应用n什么是细胞融合？什么是细胞融合？n为什么要进行细胞融合？为什么要进行细胞融合？n简述细胞融合的研究历史简述细胞融合的研究历史第一节第一节 细胞融合概述细胞融合概述一、细胞融合的概念和意义一、细胞融合的概念和意义1.1.概念概念 细细胞胞融融合合（cell cell fusion)fusion)又又称称体体细细胞胞杂杂交交（somatic somatic hybridization)hybridization)，即即在在自自然然条条件件下下或或用用人人工工方方法法(生生物物的的、物物理理的的、化化学学的的)使使两两个个或或两两个个以以上上的的细细胞胞合合并并形形成成一一个个细细胞胞或或使使之之分分化化再再生、形成新物种或新品种的技术生、形成新物种或新品种的技术v克服物种间克服物种间杂交不亲和杂交不亲和或或不能受精不能受精或或胚胎早期胚胎早期败育败育，为遗传物质广泛重组提供新途径为遗传物质广泛重组提供新途径如：薯番茄、番茄薯如：薯番茄、番茄薯2.2.意义意义3.3.细胞融合的类型细胞融合的类型 n 19781978年年，德德国国科科学学家家梅梅罗罗帕帕斯斯博博士士向向世世界界宣宣告告，他他用用马马铃铃薯薯与与番番茄茄相相结结合合，得得到到了了地地上上部部分分结结青青色色果果实实的的“薯薯番番茄茄”，但但地地下下尚尚未未结结出出马马铃铃薯的块茎。

薯的块茎n后后来来，美美国国堪堪萨萨斯斯州州立立大大学学的的科科学学家家，把把番番茄茄和和马马铃铃薯薯的的细细胞胞部部分分融融合合在在一一起起，培培育育出出了了地地上上结结黄黄色色果果实实、地地下下长长白白色色薯薯块块的的“番番茄茄薯薯”，据说番茄的产量很高据说番茄的产量很高v 创造细胞质杂种创造细胞质杂种 某些农艺性状如：细胞质雄性不育、某些农艺性状如：细胞质雄性不育、除草剂抗性等都是由细胞质控制的除草剂抗性等都是由细胞质控制的有性杂交中雄配子携带细胞质极少，有性杂交中雄配子携带细胞质极少，难以产生细胞质杂种；难以产生细胞质杂种；细胞融合的杂种细胞质能够选择某细胞融合的杂种细胞质能够选择某一亲本的叶绿体，但线粒体可实现双一亲本的叶绿体，但线粒体可实现双亲重组v为遗传学研究提供新的手段为遗传学研究提供新的手段如：核质相互关系、基因作用与定位、肿瘤的如：核质相互关系、基因作用与定位、肿瘤的发生等二、基本原理二、基本原理v细胞融合的基本原理是什么？细胞融合的基本原理是什么？v简述细胞融合的大致过程简述细胞融合的大致过程1.1.相关概念：相关概念：n合胞体合胞体(synkaryon)(synkaryon)：在细胞融合过程中，开始阶段只来自两个细胞的在细胞融合过程中，开始阶段只来自两个细胞的细胞质先聚集在一起，而细胞核仍保持彼此独立，这种特定阶段的细细胞质先聚集在一起，而细胞核仍保持彼此独立，这种特定阶段的细胞结构称为合胞体。

胞结构称为合胞体n同核体同核体（homokaryonhomokaryon，同核融合细胞）：基因型相同的细胞融合成的，同核融合细胞）：基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体是由同源的原生质体融合产生的杂交细胞称为同核体是由同源的原生质体融合产生的n异核体异核体（heterokaryon,heterokaryon,异核融合细胞）：来自不同基因型的细胞融合异核融合细胞）：来自不同基因型的细胞融合形成的杂交细胞为异核体由非同源的原生质体融合产生的形成的杂交细胞为异核体由非同源的原生质体融合产生的n杂种细胞（体细胞杂种）杂种细胞（体细胞杂种）：来自不同细胞核的染色体合并到一个细胞：来自不同细胞核的染色体合并到一个细胞核内，产生出杂种细胞由于这种杂种细胞的双亲都是体细胞，因此核内，产生出杂种细胞由于这种杂种细胞的双亲都是体细胞，因此又叫做体细胞杂种又叫做体细胞杂种2.2.基本原理基本原理n细胞质膜的特性细胞质膜的特性n细胞膜融合的原理细胞膜融合的原理质膜靠近，质膜靠近，质膜局部区域紧密粘连，磷质膜局部区域紧密粘连，磷脂分子重排，形成细胞桥；脂分子重排，形成细胞桥；胞质融合，胞质融合，细胞核融合。

细胞核融合3.3.细胞融合大致过程细胞融合大致过程植植物物细细胞胞融融合合过过程程人人造造小小鼠鼠培培育育过过程程示示意意图图三、细胞融合方法三、细胞融合方法v 细胞融合方法有哪些？试述其原理细胞融合方法有哪些？试述其原理1.11.1植物或微生物原生质体的制备植物或微生物原生质体的制备1.21.2动物单个细胞的获得动物单个细胞的获得 首首先先获获得得动动物物组组织织，然然后后经经消消化化液液消消化化获获得得单单细细胞胞常常用用消消化化液液：胰胰蛋蛋白白酶酶适适于于细细胞胞间间质质较较少少的的软软组组织织；胶胶原原酶酶适适于于消消化化胶胶原原和和细细胞胞间间质质丰富的纤维组织、癌组织等丰富的纤维组织、癌组织等1.融合材料融合材料 2.融合方法融合方法诱导融合的方法种类：诱导融合的方法种类：离子诱导融合法；离子诱导融合法；l 化学诱导化学诱导 高钙高钙-高高pH法；法；PEG（聚乙二醇）法聚乙二醇）法离心振荡离心振荡l 物理诱导物理诱导 显微操作显微操作 电融合电融合l 生物法生物法 仙台病毒法仙台病毒法2.1 化学法化学法2.1.1离子诱导融合法离子诱导融合法：常用的盐类离子有硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、常用的盐类离子有硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、氯化钙等。

氯化钙等钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝聚的原生质体得质膜紧密接触，促进细胞融合聚的原生质体得质膜紧密接触，促进细胞融合1970年，年，Power用硝酸钠使玉米和燕麦根尖细胞原生质体用硝酸钠使玉米和燕麦根尖细胞原生质体进行了融合进行了融合;1972年年,Carlson也用硝酸钠作融合剂，获得第一也用硝酸钠作融合剂，获得第一个烟草种间体细胞杂交植株个烟草种间体细胞杂交植株该方法异核体形成频率低，该方法异核体形成频率低，0.1-4%2.1.2 高钙-高pH法：n首先用于人和鼠的动物细胞杂交，后来引用在植首先用于人和鼠的动物细胞杂交，后来引用在植物原生质体的融合，并利用这种融合方法获得了物原生质体的融合，并利用这种融合方法获得了烟草体细胞杂种（烟草体细胞杂种（1973年，年，50mmol/L钙离子、钙离子、pH值值10.5）n钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结合；高合；高pH值能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合值能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合n该方法高该方法高pH值对原生质体有害。

值对原生质体有害n异种融合效率达异种融合效率达10-35%(高国楠高国楠,1974)PEG是一种多聚化合物，分子量在是一种多聚化合物，分子量在20020000之间，毒性小易操作之间，毒性小易操作用用PEG法与高钙法与高钙-高高pH法结合法结合:制备两亲本制备两亲本的原生质体，并至合适密度（的原生质体，并至合适密度（105个个/ml）；将）；将PEG溶液加入，并孵育一段时间（溶液加入，并孵育一段时间（24或或37，1020分钟）；缓缓加入高钙高分钟）；缓缓加入高钙高pH溶液溶液15分分钟；洗涤，收集细胞计算融合率钟；洗涤，收集细胞计算融合率融合促进剂融合促进剂:伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A，二甲基亚砜和，二甲基亚砜和链胃蛋白酶等，提高细胞的融合频率链胃蛋白酶等，提高细胞的融合频率2.1.3 PEG（聚乙二醇）法（聚乙二醇）法nPEGPEG含有醚键而具有含有醚键而具有负极性负极性，与水、蛋白质和碳水，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团形成氢键化合物等一些正极化基团形成氢键当当PEGPEG分子足分子足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。

而使之粘连nPEGPEG也也能连接能连接Ca2+Ca2+等阳离子等阳离子Ca2+Ca2+可在一些负极化可在一些负极化基团和基团和PEGPEG之间形成桥，因而促进粘连之间形成桥，因而促进粘连;n在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEGPEG分子可分子可被洗脱，引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原被洗脱，引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合生质体融合;n高高Ca2+Ca2+高高pHpH清洗增加了质膜的流动性，大大提高清洗增加了质膜的流动性，大大提高了融合频率了融合频率PEG诱导融合原理诱导融合原理蟾蜍血细胞融合实验蟾蜍血细胞融合实验蟾蜍血细胞融合实验蟾蜍血细胞融合实验 物理诱导融合包括物理诱导融合包括离心振荡、显微操作和电离心振荡、显微操作和电融合融合 显微操作显微操作：显微操作将大熊猫体细胞注入去：显微操作将大熊猫体细胞注入去核兔卵母细胞卵周隙中核兔卵母细胞卵周隙中2.2 物理诱导融合物理诱导融合 电融合电融合 原理：原理：细胞处于不均一的细胞处于不均一的交变电场交变电场，细胞极化，细胞极化成为偶极子，排列成串珠状，再施加成为偶极子，排列成串珠状，再施加瞬间强脉冲瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。

使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合在融合仪控制下的融合小室内进行各种指标在融合仪控制下的融合小室内进行各种指标都可精细调节控制，融合效率高都可精细调节控制，融合效率高（zimmermann1981,融合频率达融合频率达60%）优点：优点：融合效率高、操作简单、重复性强、无融合效率高、操作简单、重复性强、无毒性、可在显微镜下直接观察细胞融合过程毒性、可在显微镜下直接观察细胞融合过程n仙台病毒：仙台病毒：亦称亦称HVJHVJ（Hemagglutinating virus of Hemagglutinating virus of JapJapanan的缩写），乙型副流感病毒属副黏液病毒的缩写），乙型副流感病毒属副黏液病毒属，属，RNARNA病毒M MKuroyaKuroya），（），（19531953）n年，日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄年，日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起，并首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起，并使膜产使膜产生一些断裂生一些断裂，两个细胞核会通过裂口融合在一起；，两个细胞核会通过裂口融合在一起；n不耐热，几乎可不耐热，几乎可凝集所有种类的红血球凝集所有种类的红血球，而且有溶血，而且有溶血性。

在鸡胚、各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖在鸡胚、各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖2.3 生物法生物法病毒法病毒法 疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒n病毒囊膜上有许多刺突（病毒囊膜上有许多刺突（spike)，刺突上都是一，刺突上都是一个单价血细胞凝集素；个单价血细胞凝集素；n刺突还有唾液酸苷酶的活性，水解寡糖链上的唾刺突还有唾液酸苷酶的活性，水解寡糖链上的唾液酸残基，攻击细胞表面液酸残基，攻击细胞表面紫外线紫外线丧失感染活性丧失感染活性（不感染细胞）（不感染细胞）保留融合活性保留融合活性（诱导细胞融合）（诱导细胞融合）仙台病毒仙台病毒程序：程序：紫外线将病毒灭活，稀紫外线将病毒灭活，稀释到一定浓度，加入到释到一定浓度，加入到细胞悬液中，离心，诱细胞悬液中，离心，诱导细胞融合导细胞融合优点：优点：融合效率高，适合于各种动物细胞；融合效率高，适合于各种动物细胞；仙台病毒在鸡胚中大量繁殖，容易培仙台病毒在鸡胚中大量繁殖，容易培养缺点缺点:仙台病毒不稳定，制备过程繁琐，易仙台病毒不稳定，制备过程繁琐，易失活，容易对细胞产生干扰；失活，容易对细胞产生干扰；3.13.1植物细胞融合植物细胞融合：植物原生。