小鼠黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态的时空变化医学论文.doc

小鼠黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态的时空变化_医学论文 作者：张凡 孙保存 赵秀兰 常永霞【摘要】 目的：利用小鼠移植瘤模型动态观察血管生成拟态的时空变化方法：采用B16黑色素瘤细胞和C57小鼠制作小鼠恶性黑色素移植瘤动物模型，成瘤后根据随机数字表每天随机抽取一只小鼠处死，共12d，获得肿瘤样本114例常规HE染色和CD31、PAS染色显微镜下分别计数肿瘤组织中央区和外周区的高倍视野（×400）下血管生成拟态以及内皮依赖性血管结果：在移植瘤形成的第1～8天，肿瘤组织内存在血管生成拟态第9～12天该结构被内皮依赖性血管替代肿瘤中央区、外周区血管生成拟态密度均呈现先递增后递减趋势；两个区域内的血管生成拟态密度比较：在第1～6天内肿瘤中央区高于外周区，在第7～8天肿瘤外周区高于中央区内皮依赖性血管在肿瘤组织的中央区和外周区呈现递减趋势两个区域内的内皮依赖性血管密度比较：在第1～7天肿瘤中央区内皮依赖性血管密度高于外周区，在第8～12d两个区域内的内皮依赖性血管密度无明显差别血管生成拟态密度与肿瘤组织的坏死率之间呈密切负相关（r=-0.978,P<0.05）；内皮依赖性血管密度与肿瘤组织坏死率之间亦存在负相关（r=-0.230,P<0.05）。

结论：黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态是肿瘤细胞为适应环境而产生的一种暂时性的血液供应方式，与内皮依赖性血管并存于肿瘤组织内随肿瘤生长变化而与内皮依赖性血管之间存在一定的时空变化 规律 【关键词】 血管生成拟态；肿瘤血管生成；恶性黑色素瘤【ABSTRACT】 Objective: To study the Spacetime Change of Vasculogenic Mimicry in the melanoma transplant tumour.Methods:The mouse melanoma transplant tumor model was made by Subcutaneous injecting in the C57mouse with B16 melanoma cell susspension liquid. When tumor appears, we choose one mouse each day randomly according to random number chart and kill it. Normal HE stain,immunohistochemistry stain and PAS stain were used. Then count the Vasculogenic mimicry and endothelial vessel under highpower microcope in centre and outside area. SPSS 10.0 statistic software was used when P<0.05 was significant. Results: There are PASpositive patterned vessels in the tumor tissue at the early phase of melanoma and erythrocytes inside the vessel. The structure decreases gradually in the center and outside area and the density of the two area has no significant difference.The endothelial vessels decrease gradually in center and outside area as well. There is negative correlation between the vasculogenic mimicry density and tumor necrosis ratio(r=-0.978,P<0.05); there is also negative correlation between the endothelial vessel density and tumor necrosis ratio(r=-0.230,P<0.05).Conclusion: The vasculogenic mimicry is one sort of special bloodproviding patterns and its appearance makes the tumor adapt the micronevironment more freely. This structure usually coexist with endothelial vessel in some tumor.The vasculogenic mimicry decreases gradually with tumor development and the density of vasculogenic mimicry between center and outside area has no significant difference.The endothelial vessel also decreases gradually with tumor development and the density of endothelial vessel between center and outside area has no significant difference.The vasculogenic mimicry is more important to the tumor blood providing than endothelial vessel in this tumor. The CD31 plays key role in this process.【KEY WORDS】 Vasculogenic mimicry； Angiogenesis; Malignant molenoma血管生成拟态是一种与传统的肿瘤血管生成途径完全不同的、不依赖内皮细胞的全新的肿瘤细胞的血液供应方式。

1999年由美国lowas大学的Maniotis和Folberg等提出，他们对眼葡萄膜恶性黑色素瘤微循环研究时发现恶性黑色素瘤细胞通过自身变形和与细胞外基质相互作用，模拟血管壁结构形成可输送血液的管道，从而重塑肿瘤的微循环，并且与宿主血管相连通，使肿瘤获得血液供应，命名为血管生成拟态[1～6]2005年10月河北北方学院学报（医学版）第5期2005年10月张 凡等：小鼠黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态的时空变化第5期血管生成拟态概念的提出丰富了肿瘤血液供应理论，但目前对它与内皮依赖性血管之间的演变规律缺乏认识，本研究在前期研究的基础上首次提出了血管生成拟态的时空变化概念：即血管生成拟态是肿瘤血液供应的一种暂时性替代模式，在肿瘤发生 发展 的一定时期内存在，在肿瘤的不同区域存在不同的变化趋势，并利用小鼠移植瘤模型连续观察对我们的假说进行验证1 材料和方法 1.1 实验动物 C57小鼠购自北京军事医学 科学 院动物室，6～8周龄，共20只，雌雄各半，体重25～30g，编号后天津医科大学实验动物中心洁净实验室饲养1.2 实验方法 先将黑色素瘤细胞株B16复苏，1640细胞培养基上培养6d，使细胞排满瓶底，0.2%胰酶消化成单细胞悬液，调整细胞密度达到1×107/ml。

75%酒精消毒小鼠鼠蹊部，每只小鼠鼠蹊部皮下注射0.2ml细胞悬液每天观察动物生命体征及肿瘤细胞生长状况，10d后接种部位开始出现皮下肿块根据随机数字表每天抽取一只小鼠处死，共持续12d解剖并仔细检查动物全身，共获得肿瘤样本114例全部标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋1.3 计算 机图象处理 一抗CD31、HMB45为鼠抗小鼠单克隆抗体，即用型，6ml包装，SNATA CRUZ生产，进口分装；CathepsinD、MMP2、MMP9兔抗多克隆抗体，使用空军总 医院 医学工程研究所的BIN DAF IMG图象采集处理系统（91年版）计算每张切片中坏死面积1.4 计数方法1.4.1 区域划分 中央区与外周区的划分：避开肿瘤坏死,将每张切片中肿瘤组织镜下视野均匀分成三等份，即内1/3、中1/3、外1/3三个区域，内1/3区域即为中央区，外1/3即为外周区血管生成拟态周围与远离血管生成拟态、内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的划分：以血管生成拟态、内皮依赖性血管为中心的高倍视野定义为血管生成拟态、内皮依赖性血管周围；距离上述视野一个高倍视野的肿瘤细胞即为远离血管生成拟态和内皮依赖性血管。

血管生成拟态判断标准：无内皮细胞衬复的PAS阳性管道、衬复PAS阳性物质的肿瘤细胞围成不规则管腔，且管腔内存在红细胞，周围没有出血坏死和炎症细胞浸润1.4.2 计数方法 低倍镜下找到血管生成拟态和内皮依赖性血管存在的典型区域，换成高倍镜（×400），连续计数10个高倍视野内的血管生成拟态、内皮依赖性血管，取其均值即为血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度同时计数血管生成拟态周围、内皮依赖性血管周围、远离血管生成拟态、远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞中各种指标阳性细胞数（各项指标均连续计数10个高倍视野，每个视野内随机计数100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其均值）1.5 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件包对该实验资料进行数据处理，以P<0.05具有统计学意义2 结果 2.1 肿瘤组织内的血管生成拟态的形态学特点通过CD31和PAS双重染色，在该移植瘤的第1～8天可见到肿瘤间质中樱桃红色的PAS阳性血管样图案，在第9～12天该结构逐渐被内皮依赖性血管所替代PAS阳性血管样图案呈现多种形状（直的、平行的、交叉的、环状的、有分支的和网状的），PAS管状结构的管壁厚薄不一，有的PAS管状结构中可以见到单行排列的红细胞。

同时可见到典型的血管生成拟态样结构：外层为CD31染色阴性的肿瘤细胞，内衬樱桃红色的PAS阳性物质，管腔内有成堆的红细胞，证实恶性黑色素移植瘤中也存在血管生成拟态结构，并且具有肿瘤血液供应功能实验中还发现有的血管生成拟态中肿瘤细胞围成的不规则管腔内无PAS阳性物质衬复，同时管腔内存在红细胞2.2 血管生成拟态和内皮依赖性血管在黑色素瘤不同移植时间和不同区域变化本实验小鼠移植肿瘤组织内的血管生成拟态出现在移植瘤形成后的第1～8天，并与内皮依赖性血管共同存在随着移植肿瘤的发展，血管生成拟态在肿瘤的不同区域呈现不同的变化趋势肿瘤中央区的血管生成拟态密度在移植瘤形成后的第1～3天呈现递增趋势，在第4～8天呈现递减趋势肿瘤外周区的血管生成拟态密度在第1～4天呈现递增趋势，在第5～8天呈现递减趋势从空间上对比两个区域内的血管生成拟态密度显示：在第1～6天肿瘤中央区的密度高于外周区的密度，在第7～8天肿瘤外周区的密度高于中央区的密度内皮依赖性血管密度在肿瘤的中央区和外周区均呈现递减趋势空间上对比两个区域内的内皮依赖性血管密度发现：在第1～7天肿瘤中央区的密度高于外周区密度，在第8～12天肿瘤两个区域内密度差别不明显。

对肿瘤中央区和外周区的血管生成拟态密度和内皮依赖性血管密度做统计学分析，结果显示两个区域内的血管生成拟态密度和内皮依赖性血管密度均无差别表1 不同区域血管生成拟态密度的比较（个/高倍视野）表2 不同区域内皮依赖性血管密度的比较（个/高倍视野）2.3 CD31在肿瘤不同区域的表达显微镜下观察发现部分的肿瘤细胞表达CD31抗原，同时围成血管生成拟态的肿瘤细胞不表达或极少表达CD31抗原，血管生。