血清成分的生化分析2.ppt

综合实验二： 血清成分的生化分析,实验五 血清胆固醇的定量测定（4学时） 实验六 血清蛋白的分离纯化（12学时） 实验七 血清中转氨酶活力的测定（8学时）,实 验 六 血清清蛋白与γ-球蛋白的分离及鉴定 生命与环境科学学院 生化组,总体步骤：盐析→透析→浓缩→电泳（期间穿插凝胶柱层析） 一、盐析 50%饱和度，血清球蛋白沉淀 α、β、γ-（33%饱和度沉淀） 100%饱和度，血清清蛋白沉淀 （NH4）2SO4：破坏水膜、中和电荷 纯度鉴定：层析（柱）、电泳等,二、透析 目的：去盐（柱层析也可） 透析袋：装样量：1/2～2/3 三、浓缩 目的：去水（蔗糖） 四、电泳 目的：鉴定清蛋白和 γ-球蛋白纯度 五、层析 练习：分离蓝葡聚糖和重铬酸钾（蓝色+黄色）,实验材料 鸡血清 ：三黄鸡血清 或乌骨鸡血清,,,实验六——（一） 血清清蛋白与 γ-球蛋白的盐析、透析与浓缩,一、目的 1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和方法 2、掌握透析法脱盐及蛋白质浓缩的方法,二、试剂及仪器用品 血清 PBS （NH4）2SO4溶液 蔗糖 双缩脲试剂 酪蛋白 BaCl2溶液 离心机 烧杯 移液管 透析袋,三、原理 中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面的双电层和水膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。

沉淀不同蛋白质所需盐类浓度不同如，50％饱和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33％饱和的硫酸铵则使 γ-球蛋白沉淀因此，可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析透析是利用蛋白质等生物大分子不能通过半透膜的性质的一类纯化方法，可利用该方法分离大分子与小分子的混合物 由于NH4+ 和 SO42- 可以通过半透膜，而血清清蛋白不能，因此，可以利用透析的方法使清蛋白溶液脱盐透析装置,利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩 将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩四、实验步骤 1、盐析、透析与浓缩 离心管,2mL 血清,,2mL PBS,,2mL （NH4）2SO4,,摇匀 静置 30′,,3000rps 离心 20′,,,,,上清液（主要含清蛋白）,沉淀（主要含γ-球蛋白）,,,3.132g（NH4）2SO4,上清液,,静置30′，离心20′,,1mL水（或PBS）,,沉淀,流水透析1h,蔗糖,,浓缩,清蛋白,,1mL PBS,沉淀,,,1mL水（或PBS）,,流水透析1h,蔗糖,,浓缩,γ-球蛋白,,滴加0.5mL（NH4）2SO4,静置30′，离心20′,沉淀（γ-球蛋白）,,实验六——（二） 血清清蛋白与 γ-球蛋白的鉴定 ——醋酸纤维薄膜电泳,一、目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作 了解电泳技术的一般原理。

二、原理 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法 醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120μm微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便，快速，样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点目前已广泛用于血清蛋白，脂蛋白，血红蛋白，糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳中蛋白质是两性电解质，在pH不等于其等电点的溶液中，可带有电荷，在电场中会向着与其所带电荷相反的电极移动 血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等蛋白质，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、形状及等电点不同，在电场中迁移速度就不同，故通过电泳法可将其分离三、实验器材 1、醋酸纤维薄膜（2×8cm） 2、常压电泳仪、电泳槽 3、点样器（市售或自制） 4、培养皿（染色及漂洗用） 5、粗滤纸、直尺、单面刀片、电吹风 6、玻璃板 7、竹镊子 8、白磁反应板等,四、实验试剂 1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）：1000mL： 巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，加水至1000mL 2、染色液：300mL 含氨基黑 10B 0.25g，甲醇50mL，冰醋酸10mL，水 40mL〈可重复使用〉。

3、漂洗液： 2000mL 含甲醇或乙醇45mL，冰醋酸5mL，水50mL 4、透明液：300mL：含无水乙醇7份，冰醋酸3份 5、血清：新鲜，无溶血现象,五、操作 总体步骤： 膜处理——30′ 装置——电泳槽 电极缓冲液：两槽等高 搭桥 点样→电泳→染色→漂洗→透明 需做三条膜：全血清、 γ-球蛋白、清蛋白,1、膜处理——膜的浸泡 用无齿镊子取醋酸纤维薄膜一张（识别出光泽面与无光泽面，并在角上做好记号）放在缓冲液中浸泡 20min2、电泳槽的准备 根据薄膜宽度剪裁合适的滤纸条在两个电极槽中各倒入等体积电极缓冲液，在电泳槽两个膜支架上各放两层滤纸条，滤纸的一端与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内当滤纸条全部润湿后，用玻棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡，使该端滤纸紧贴于膜支架上滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥3、点样 把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸中吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）将点样器先于放置在白磁反应板上的血清中沾一下，再在膜条一端2～3cm处轻轻地水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品点样说明： 点样位点不可直接在薄膜上划线，以免破坏薄膜。

可制备点样模板：取等大小滤纸条，在距纸边1.5～2cm处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区 点样后要在薄膜上形成具一定宽度、粗细均匀的直线此步骤是实验关键，是获得具有清晰区带电泳图谱的重要环节点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样4、电泳 将膜条上点样的一端靠近负极（点样面朝下，要求膜紧贴滤纸并绷直，中间不能下垂若电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜间应相隔几mm）盖严电泳室，平衡10min调节电压到160V，电流强度0.4～0.6mA/cm（毫安/厘米）膜宽，电泳时间约为45～60min5、染色 电泳完毕后，将膜条取下并放在染色液中浸泡5～10min 6、漂洗 将膜条从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次到无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱7、定量 ⑴、将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在4.0mL 0.4mol/L氢氧化钠溶液中半小时，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，在A650nm进行比色⑵、将干燥的电泳图谱膜条放在洁净的玻璃板上，将透明液滴入，待膜条完全透明后用吹风机吹干或放入烘箱中烘干，可用光密度计直接测定，此图谱可长期保存实验六——（三） 凝胶层析（练习实验）,一、目的 掌握凝胶过滤层析的技术方法,二、凝胶柱层析原理 1、凝胶层析也称凝胶过滤，是一类利用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析技术。

2、当样品流经这类凝胶的固定相时，不同分子大小的各组分因进入网孔受阻滞的程度不同而以不同的速度通过层析柱，从而达到分离的目的3、当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚本实验采用Sephandex G-25凝胶柱分离重铬酸钾和蓝葡聚糖混合物 Sephandex：葡聚糖凝胶G20、G30······G200等，编号越小，筛孔越小根据需要选取适当型号可分离高分子物质或脱盐等三、试剂及仪器用品 （1）Sephandex G-25 （1）铁架台 （2）生理盐水 （2）凝胶柱 （3）重铬酸钾 （3）玻璃棒 （4）蓝葡聚糖 （4）烧杯 （5）试管 （6）胶头吸管,四、实验步骤 1、凝胶预处理 称取 8g G-25 → 放入250mL烧杯中 → 100mL蒸馏水→小火煮沸1h → 静止、冷却 → 倾弃蒸馏水→ 加入10mL PBS → 轻轻搅拌至凝胶悬起→ 倾入10cm×1.0cm层析柱。

2、装柱 将全部凝胶都倾入柱内，当液面接近凝胶面时，用螺旋夹将橡胶管夹紧，然后小心放松螺旋夹，使液体缓慢流出（4～5d/m），到液体刚好流入凝胶面时，将螺旋夹再夹紧，装柱工作完成3、加样 用胶头吸管将柱中上方清液吸出，加入重铬酸钾和蓝葡聚糖混合溶液，用胶塞封住上口 4、洗脱 用生理盐水洗脱液进行洗脱打开螺旋夹，使液体的流速达到10～15d/m5、收集 混合液在凝胶柱中分离，蓝色的蓝葡聚糖在下方，黄色的重铬酸钾在上方用试管收集流出蓝、黄色液体，比色并画出洗脱曲线五、实验结果,可通过凝胶过滤对样品脱盐,一、实验原理,*盐析分离所得之γ-球蛋白，在进一步纯化之前，先要将其中的硫酸铵除去凝胶过滤法较之透析法是一种快速有效的方法 *当蛋白质、硫酸铵混合物流经Sephadex G-25 柱时，硫酸铵渗入 Sephadex G-25 内部，而蛋白质被排阻在外，因此，蛋白质随溶剂先流出，硫酸铵后流出故能将二者分开二、操作方法,1．装柱,*取层析柱1根（1.5×20cm），垂直于固定架上，夹住流出口； *加10ml磷酸盐缓冲液（0.0175 mol/L，pH6.7）于柱中； *将溶胀好的Sephadex G－25倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液（0.0175mol/L，pH6.7）并搅拌成悬浮液； *慢慢将凝胶装入柱中，打开流出口； *继续加入SephadexG－25使自然沉降至15cm高，关闭出口。

2.上样,*打开出口，使柱中多余的磷酸盐缓冲液流出至凝胶柱床面（切勿低于柱床面）； *用吸管吸取盐析所得的蛋白质溶液2ml，沿管壁加入凝胶面上； *打开流出口，让样品进入凝胶柱； *再用滴管小心加入磷酸盐缓冲液至离凝胶面2～3cm高； *接通装有磷酸缓冲液的洗脱瓶开始洗脱； *调节流速为0.5ml／min，每2ml收集1管，编号，按顺序放在试管架上3.检测,（1） 在收集的同时，检查蛋白质是否流出： *于每管中取出1滴放在黑色比色板孔中(按编号顺序）； *再分别加入1滴20％磺酰水杨酸，如出现白色沉淀即表示蛋白质已流出凝胶柱； *如此再检查到蛋白质全流出为止 （2）与此同时，检测蛋白收集液中是否有硫酸铵： *再从含蛋白质的管中取出1滴于白色比色板中； *加入奈氏试剂1滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋白质中的硫酸铵已除去， （3）合并无硫酸铵的蛋白质管，待用。