提取酵母细胞壁中葡聚糖的新方法.doc

提取酵母细胞壁中 B-D-葡聚糖的新方法摘 要 研究了一种从酵母细胞壁中提取 B-D-葡聚糖的新方法,包括高温抽提、脱脂和酶解 3部分在高温条件下分别考察了 pH、料液比、温度及时间对 B-D-葡聚糖得率和纯度的影响结果表明,高温提取的最佳工艺条件为:料液比为 1B15、pH=8、温度 120e,时间 3 h,B-D-葡聚糖得率为 61105%,纯度达到 41151%;为了进一步提高 B-D-葡聚糖的纯度,采用了脱脂和酶解的方法去除粗多糖中的蛋白质、脂质等杂质,最终产品的纯度达到 78131%关键词 B-D-葡聚糖,酵母细胞壁,提取B-D-葡聚糖是一种极富生物活性的多糖,具有较强的免疫及抗肿瘤活性在酵母细胞壁中含有大量的 B-D-葡聚糖目前该资源主要是作为饲料廉价销售,造成资源浪费,利用现代科技手段从酵母细胞壁中提取 B-D-葡聚糖是实现其综合利用的有效措施传统的提取方法有酸法、碱法、酸碱结合方法,但提取条件都较为剧烈,且酸碱试剂易腐蚀设备,环境污染严重,尤其是在提取过程中部分 B-D-葡聚糖会降解,造成产品得率与生物活性的降低本文采用了一种较为温和的提取 B-D-葡聚糖方法,包括高温抽提、脱脂和酶解 3 部分,操作过程简便、快速,易于大规模生产,更为重要的是避免了酸碱条件对产品带来的降解作用,同时副产物甘露聚糖是动物营养与免疫研究和应用中的主要功能性多糖,因而具有一举两得的效果。

1 材料与方法111 仪器Waters 600 高效液相色谱仪(配置 Waters 600 四元输液泵, 2410 示差折光检测器, 7725 i 进样阀,Empower 色谱工作站);高压灭菌锅(上海第一医疗器械厂);QT-1 漩涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司);德国 ChristALPHA 1-4LSC 冷冻干燥机(北京鑫盛鸿阳科技有限公司);Avanti J-26XP 系列高效离心机(贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司)112 试剂酵母细胞壁(安琪酵母有限公司提供),蛋白酶Protamex、Savinase、Neutrase、Alcalase 214L(丹麦 No-vozymes 公司提供),Protex40L(Genencor 公司提供),胰蛋白酶和 CP 酶(复合蛋白酶)(无锡杰仁生物科技公司提供),所有化学试剂均为分析纯113 B-D-葡聚糖的提取高温提取:用缓冲液配成一定质量浓度的酵母细胞壁悬浮液于 250 mL 三角瓶中(加入直径 015cm 玻璃珠),分别在不同 pH、时间、温度、料液比下进行高温抽提,离心,沉淀用水洗涤 3 次,冷冻干燥,得到水不溶性粗多糖,备用脱脂:取得到的水不溶性粗多糖,按照 1B20(gBmL)的比例分别与不同的有机溶剂配成悬浮液,不同有机溶剂为:V(正己烷)BV(甲醇)=4B1、异丙醇、石油醚、无水乙醇、正己烷等,加热回流 5 h,进行脱脂处理,反应结束后得到脱脂粗多糖, 40e 真空干燥,备用。

酶解:脱脂得到的粗多糖经酶解脱去残余蛋白质,采用的蛋白酶有:中性蛋白酶 Neutrase、碱性蛋白酶 Savinase,Alcalase 214T 及 Protex 40L、复合蛋白酶Protamex、胰蛋白酶和 CP 酶等,反应结束后,得到的残渣用水洗涤 3 次,离心,再加水复溶后于 100e 加热 5 min 灭酶,离心,真空干燥,得到淡黄色粉末即为B-D-葡聚糖产品114 B-D-葡聚糖含量的测定H2SO4 水解:准确称取 100 mg 左右酵母细胞壁粉末(B-D-葡聚糖产品或其中间产物粗多糖)于 25mL 具塞试管中,加入 115mL 72% H2SO4,漩涡混匀,室温静置 3 h,然后加入一定浓度阿拉伯糖溶液作为内标物,再加入去离子水使 H2SO4 的最终浓度为 1 食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES190 2011 Vol137 No11 (Total277)mol/L,充氮气,真空封管, 100e 水解 5 h,取出冷却至室温,用 Ba(OH)2 中和,离心,得上清液 A,用水洗涤3 次,合并 A 和所得洗涤液,最后定容至 100 mL,过滤后用 HPLC 进样检测。

色谱条件:色谱柱: Sugar-Pak 1 615 mm i1d1@300 mm;流动相:超纯水;流速: 014 mL/min;柱温:85e;检测:示差折光检测器B-D-葡聚糖含量的计算:称取一定量的内标物,加入到葡萄糖中组成标准品溶液,然后将相同量的内标物加入到同体积的样品溶液中组成样品溶液,将 2种溶液分别进样,根据下述公式计算得到样品中葡萄糖的含量再乘以葡聚糖的转换系数 019,得到样品中葡聚糖的含量Ai/As)样品(Ai/As)标准=(Ci% )样品(Ci% )标准式中, i 为葡萄糖, s 为阿拉伯糖115 总蛋白含量的测定采用凯氏定氮方法116 脂质含量的测定准确称取 5 g 左右干燥样品,按照 1B20(gBmL)的比例与 V(正己烷)BV(甲醇)=4B1 配成悬浮液,加热回流 5 h,然后将所得抽提物冷却至 40e,蒸发得A1;经抽提后所得残留物依次经正己烷、甲醇、丙酮溶液洗涤,合并 A1 和所得洗涤液,旋转蒸干至恒重,准确称重并计算脂质含量117 分子质量分布分析高效体积排阻色谱法(HPSEC)仪器:Waters 600 高效液相色谱仪(配 2410 示差折光检测器和 M32 工作站)。

色谱条件:色谱柱:UltrahydrogelTMLinear300 mm@718 mm id@2;流动相: 011 mol/L NaNO3;流速:019 mL/min;柱温: 45e;进样体积: 10LL样品制备:样品用二甲亚砜溶解、配制成 3~5mg/mL 溶液, 50e 超声处理 2~3 min相对分子量校正曲线所用标准品: Dextran T-2000 (MW2000 000), DextranT-580(MW580 000),Dextran T-190 (Mw188 000 ), Dextran T-70 (MW70 000),DextranT-10 (MW10 000),DextranT-5 (MW4 600),Maltopentaose (MW828)2 结果与讨论211 料液比对粗多糖纯度和得率的影响在反应温度 120e,时间 4h, pH810(011 mol/L磷酸盐缓冲溶液配制)的条件下,考察料液比对粗多糖纯度和得率的影响,结果如图 1粗多糖的纯度随着缓冲液比例的增加而升高,得率随着缓冲液比例的增加而下降,这是由于缓冲液比例的增加使得酵母细胞壁粉末与缓冲溶液之间的抽提作用更加充分,甘露聚糖蛋白溶出增多,所以粗多糖纯度升高,随之得率下降。

图 1 料液比对粗多糖纯度和得率的影响212 pH 值对粗多糖纯度和得率的影响准确称取 5 g 左右酵母细胞壁粉末,按照 1B10(gBmL)料液比,温度 120e,时间 4 h, pH 值分别为510、610(用 011 mol/L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)、710、715、810(用 011 mol/L 磷酸盐缓冲液配制); 815、910、915、10(011 mol/L 硼酸氯化钾-氢氧化钠缓冲液配制)的条件下,考察 pH 值对粗多糖纯度和得率的影响图 2 pH 值对粗多糖得率和纯度的影响如图 2 所示,在弱酸性至碱性范围内,粗多糖纯度的变化主要在 pH 值 715~815 有明显下降的趋势,随着 pH 值进一步增大,纯度逐渐升高;得率出现先下降再上升再下降的变化趋势因为酵母细胞壁中含有的甘露聚糖蛋白不易溶于弱酸性环境,但能以整体形式溶于碱性条件,所以随着 pH 值从弱酸性变化到中性(5~7),甘露聚糖蛋白的溶解性逐渐增大,得率逐渐下降;随着 pH 值的进一步增大,得率反而上升,这可能是因为酵母细胞壁中含有的蛋白质在等分离与提取2011 年第 37 卷第 1 期(总第 277 期)191 电点时溶解度降低,易沉淀析出,导致粗多糖得率上升的原因;在 pH 值 815~10,甘露聚糖蛋白能以整体溶于碱性条件,所以得率会下降。

综合考虑到粗多糖纯度、得率以及过碱会造成粗多糖降解等影响因素,最终选择 pH715~8 的范围优化提取的最佳组合213 温度对粗多糖得率和纯度的影响按照料液比 1B10(gBmL), pH 值 8(011 mol/L 磷酸盐缓冲液配制),反应 4 h 条件下,考察温度对粗多糖得率和纯度的影响如图 3 所示,随着温度的升高粗多糖得率在 100~110e 下降明显,随后温度升高得率变化趋于平缓;纯度随着温度的升高而增大,考虑到高温有可能导致多糖结构降解,故选择反应温度为 115~125e图 3 温度对粗多糖得率和纯度的影响214 时间对粗多糖得率和纯度的影响按照料液比 1B10(gBmL), pH8(011 mol/L 磷酸盐缓冲液配制),温度 120e 的反应条件下,考察时间对粗多糖得率和纯度的影响,结果如图 4 所示图 4 时间对粗多糖得率和纯度的影响随着时间的延长纯度呈现上升的趋势, 4 h 后纯度变化趋于稳定;得率随时间延长呈现出下降的趋势,在 3h 后值趋于稳定随着抽提时间的延长,甘露聚糖蛋白溶出值基本不变,考虑到高温可能使粗多糖造成一定的降解,因此时间并非越长越好,选择在 3~5 h 即可。

215 正交试验考察粗多糖得率和纯度的影响在单因素试验考察的基础上,选择在 pH 值为810 的条件下,从温度、时间、料液比 3 个影响因素设计正交实验,考察其对得率和纯度的影响表 1 正交试验因素水平表水平因素温度/e 提取时间/h 料液比(gBmL)1 115 3 1B102 120 4 1B153 125 5 1B20表 2 正交试验结果试验号温度/e 时间/h 料液比(gBmL)纯度/%得率/%1 115 3 1B10 34108 701482 115 4 1B15 35121 621183 115 5 1B20 38141 60164 120 3 1B15 41151 611055 120 4 1B20 38152 591686 120 5 1B10 33192 641337 125 3 1B20 36139 561698 125 4 1B10 37153 631499 125 5 1B15 26 60156k13519 37132 35117k237198 37108 34124k33313 32178 37177R4168 4154 3153比较表 2 中的几个因素的极差 R 可以看出,影响酵母粗多糖纯度的各因素的顺序为:温度﹥时间﹥料液比,且在 pH 值 8、时间 3 h、温度 120e、料液比为 1B15 的条件下纯度最高为 41151%,虽然此条件下得率不是最高,但是考虑首要目的是要提高纯度,所以选择最佳抽提组合为时间 3 h、温度 120e、料液比为 1B15。

216 有机溶剂处理采用不同的有机溶剂对高温抽提得到的酵母粗多糖进行脱脂处理,如图 5,实验结果表明实验室仅作分析用 V(正己烷):V(甲醇)=4B1 的脱脂效果最好,如果工业化生产考虑到甲醇的安全性问题,可以用无水乙醇代替A-V(正己烷)BV(甲醇)=4B1;B-V(正己烷)BV(乙醇)=4B1;C-正己烷; D-无水乙醇; E-石油醚; F-异丙醇图 5 不同有机溶剂对脂质去除的影响食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES192 2011 Vol137 No11 (Total277)另外,经高温抽提得到的细胞壁中还含有蛋白质,脂质的存在可能会影响蛋白酶的作用效果,因此考察比较了脱脂与蛋白酶处理的先后顺序的影响,选择了碱性蛋白酶 Savinase,实验结果证明先脱脂后蛋白酶处理测得总蛋白含量为 4194%,蛋白酶处理后脱脂测得为 5150%,所以,采用先脱脂后蛋白酶处理的工艺。