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1ELISA 夹心法定量检测 rhGM-CSFIL-3 融合蛋白方法的建立作者：袁淑云蔡宗友饶颖竹肖桂元【关键词】 ELISA 夹心 【摘要】 目的 建立一种快速灵敏的定量测定 rhGM-CSF/IL-3 融合蛋白的方法方法采用 ELISA 双抗体夹心法结果 当 rhGM-CSF/IL-3 浓度在0.49～6.25ng/ml 时呈线性关系，回归系数为 r=0.995，建立的方法与各种血液组份和细胞因子无交叉反应，灵敏度 49pg/ml，批内变异系数为 5.96%，批间变异系数为 7.08%结论 该法检测速度快，重复性好，灵敏度高，特异性好关键词 rhGM-CSF/IL-3 融合蛋白 ELISA 法本文对大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-3（rhGM-CSF/IL-3）融合蛋白进行了中试纯化研究，进一步的研究表明 rhGM-CSF/IL-3 体外能促造血祖细胞的生长发育，具有较好的开发应用前景为了进一步研究其在体内的药效以及药代动力，必须对其进行定量测定但目前尚无一简便有效的检测方法对 rhGM-CSF/IL-3 进行定量检测基于 rhGM-CSF/IL-3 的免疫特性，本文建立了 ELISA 夹心法 ［1］ 定量检测 rhGM-CSF/IL-3。

1 材料与方法1.1 主要试剂 鼠抗剂 rhGM-CSF 单克隆抗体（rhGM-CSF McAb）为自制;鼠抗rhGM-CSF 多克隆抗体（rhGM-CSF PcAb） 、兔抗 rhIL-3 多克隆抗体（rhIL-3PcAb） 、酶标记羊抗兔 IgG（购自 Amcrsham 公司）;LPS、HRP、BSA（购自SIGˉMA 公司）;G-CSF、rhGM-CSF、EPO（购自 Amgen 公司）;IL-2（购自 Cetus公司）;rhGM-CSF、IFN-α（购自 Schering-Plough 公司） 1.2 ELISA 夹心法测定 rhGM-CSF/IL-3 融合蛋白 用 250mmol/L 磷酸盐缓冲液（PBS pH8.0）按适当比例稀释的 rhGM-CSF McAb100μl 包被微孔板，20℃16h，将 A 液（0.1%Tween-20 的 PBS）洗板 5 次，加 200μl1%BSA-PBS 溶液 20℃封闭 6h，A 液洗板，甩干，-20℃保存备用使用时解冻，每孔加样本100μl，4℃16h;A 液洗板 5 次，加 B 液（0.1%Tweem-20，0.1%BSA in50mmol/L PBS，pH7.3）适当稀释的 rhIL-3PcAb100μl1h;A 液洗板 5 次，加 100μl HRP-羊抗兔 IgG，37℃1h;A 液洗板，加 100μl OPD 显色液（1mg/ml 邻苯二胺，0.012%H 2 O 2 ，100mmol/L 柠檬酸-磷酸缓冲液，pH5.0） ，30min 后用 2mol/L H 2 SO 4 100μl 终止反应，用酶标仪检测 OD 490nm 值。

1.3 矩阵法选择包被第一抗体与桥联抗体量 用棋盘测定法确定各抗体最适浓度，选择 rhGM-CSFMcAb 浓度为 1、5、10、15μg/ml，rhIL-3PcAb 稀释度为1:10、1:100、1:1000 稀释时，分别测定 OD 490nm 值，以其 OD 490nm 值稳定时，低浓度值为最佳浓度2 结果2.1 测定条件的优化 用棋盘测定法测定 5ng/ml 的 rhGM-CSF/IL-3，表明hGM-CSFMcAb 的最佳浓度为 10μg/ml，rhIL-3PcAb 的最佳稀释度为1:100100μl 可以产生足够陡的剂量反应曲线，且本底低，是最佳反应体积测定最低检测浓度至少需要显色 30min 2.2 特异性和灵敏度 用建立的2ELISA 法测定血清主要组份和细胞因子的干扰性，表明 LPS（100μg/ml） 、BSA（10μg/ml） 、G-CSF（2μg/ml） 、EPO（0.1μg/ml） 、IL-2（0.08μg/ml） 、rhGM-CSF（2μg/ml） 、IFN-α（0.5μg/ml） 、rhIL-3（2μg/ml）与正常人血清rhGM-CSF/IL-3 无交叉反应性。

见表 1典型 rhGM-CSF/IL-3 标准剂量反应曲线表明该法最低检测浓度为 50pg/ml2.3 回收率 将已知量标准 rhGM-CSF/IL-3 用已经建立的方法测定，回收率为 92%～108%2.4 批内变异与批间变异 测定了低、中、高三个浓度的批内变异，变异系数为 5.96%（0.654±0.039，n=10）;批间变异测定在不同日期进行，批间变异系数为 7.08%（0.678±0.048，n=5） ，低浓度样品变异系数稍大3 讨论GM-CSF 与 IL-3 是功能性相关的糖蛋白家族成员，对红细胞系统，嗜中性、嗜碱性、嗜酸性粒细胞、巨核细胞和单核/巨噬细胞系在刺激细胞生存、增殖与分化上有交叠（overlap）作用 ［2］ GM-CSF 与 IL-3 在体外对鼠和恒河猴刺激造血有协同作用，二者已开始用于临床，但同时使用副作用较大，美国已通过基因工程在酵母中表达出一种称为 PIXY321（GM-CSF/IL-3）的融合蛋白进行临床试验，已证实应用前景可观 ［3］ rhGM-CSF/IL-3 是由短链接头（Iˉinker）连接接含 GM-CSF 与 IL-3 活性成分的融合蛋白目前，对其活性研究仍以 GM-CSF 敏感细胞株 TF-1 来进行 MTT 法测定，但该法操作繁琐、条件要求高、试验周期长。

为能对 rhGM-CSF/IL-3 进行药代动力学研究，根据 ELLSA 方法的特异性是由从血清中免疫吸附 rhGM-CSF/IL-3 的 rhGM-CSF McAb 决定，灵敏度由多价兔血清、多价 检测试剂和酶介导反应决定的原则，建立了 ELISA 夹心法以矩阵法进行最佳抗体量选择，rhGM-CSF McAb 浓度 100μg/ml 作为包被第一抗体最佳浓度，1:100 稀释作为 rhGM-CSF PcAB 最佳稀释度，用最佳抗体量确定的 ELISA 夹心法检测 5ng/ml 的 rhGM-CSF/IL-3，结果比较理想，阴性对照背景干扰少，结果见表 1当 rhGM-CSF/IL-3 浓度在 0.49～6.25ng/ml 时呈线性关系，回归系数为 r=0.995，灵敏度为 49pg/ml，说明该法灵敏高重复性测定表明在每一板内样品的批内变异系数为 5.96%;在不同日期进行测定的样品的批间变异系数为 7.08%，体现了该法重复性好以 LPS（100μg/ml）等作为潜在干扰物加入血清中进行测定，这些物质对1ng/ml 的 rhGM-CSF/IL-3 水平测定背景干扰没有显著改变，显示了本法的特异性非常高。

综上所述，本试验建立的 ELISA 夹心法检测速度快、重复性好、灵敏度高、特异性好，可对样品浓度低至 50pg/ml 进行定量测定，几乎不受其它生物活性物质及血清成分的干扰，是对 rhGM-CSF/IL-3 进行有效检测的好方法表 1 ELISA 夹心法检测血清中 rhGM-CSF/IL-3 融合蛋白略参考文献1 周少雄.双抗体夹心 ELISA 测定血清促红细胞生成素.临床检验杂志，1998，16（4）:211-213.2 戴盛明.大肠杆菌中表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-3（rhGM-CSF/IL-3）融合蛋白的纯化.药物 生物技术，1998，5（2）:70-73.3 Broxm eyer B，benninger L，Cooper s，et al.Effects of in vivo treatment with PIXY321（GM-CSF/IL-3fusion protein）on prolifeation 3kinetics of bone marrow and blood myeloid progenitor cells in patient with sarcoˉma.Exp Hematol，1995，23:335.。