包涵体纯化液体配制.doc

包涵体洗涤液I50mmol/LTris-HCl（pH8.0）100mmol/LNaCl10mmol/LEDTA（pH8.0）0.5%（v/v）TritonX-100包涵体洗涤液II包涵体洗涤液I2mol/L尿素包涵体洗涤液III（pH9.0）包涵体洗涤液I4mol/L尿素包涵体溶解液50mmol/LTris-HCl（pH9.0~10.0）100mmol/LNaCl1mmol/LEDTA（pH8.0）0.5%（v/v）TritonX-1008mol/L尿素5mmol/LDTT包涵体复性缓冲液（pH8.0）1xPBS1mmol/LEDTA（pH8.0）2.2.2.6VP1重组蛋白的纯化回收2.2.2.6.1 包涵体洗涤按最佳条件诱导表达基因工程重组菌400mL,离心收集菌体冰浴中进行超声裂解，裂解后离心收集沉淀将沉淀悬浮于9倍体积的包涵体洗涤液丨中，混匀后室温放置5~10min,4°C12000r/min离心20min,分别收集上清与沉淀接着，再将沉淀悬浮于9倍体积的包涵体洗涤液II中，混匀后室温放置5~10min,同样12000r/min离心20min后收集上清与沉淀最后将沉淀悬浮于9倍体积的包涵体洗涤液III中，混匀后室温放置5~10min，4C12000r/min离心20min后收集上清与沉淀。

取少量的洗涤上清和重悬的沉淀进行SDS-PAGE电泳，检查包涵体的洗涤情况2.2.2.6.2 包涵体溶解用包涵体溶解液溶解沉淀，初始体积为100mL的诱导菌约用10mL包涵体溶解液溶解，室温作用1~2h，其间不断振荡4C12000r/min离心20min后收集上清和沉淀取少量溶解上清和重悬的沉淀进行SDS-PAGE电泳，检查包涵体的溶解情况2.2.2.6.3 包涵体的复性将溶解的包涵体上清装入已处理的透析袋内，置复性缓冲液中4C条件下进行梯度透析，复性缓冲液中尿素浓度依次递减4.5mol/L、3.5mol/L、.5mol/L、1.5mol/L、0.5mol/L和0mol/L,（6M4M2M0MPBSH2O）换液间隔时间为10~12h取出透析后的蛋白溶液于4C12000r/min离心20min,收集上清分别取少量的上清和重悬的沉淀进行SDS-PAGE电泳，检查包涵体的复性情况2.2.2.6.4 SDS-PAGE电泳及电洗脱参照分子克隆实验指南的方法配制12%的分离胶，按Bio-RAD产品说明书装好制胶板，加入分离胶（使梳子到胶面的距离约1cm），胶面上加一层水，室温放置待胶充分聚合后吸干水份，加入配好的浓缩胶，装上梳子，胶充分聚合后拔出梳子即可上样进行电泳。

收集复性后的包涵体加入等体积2xSDS上样缓冲液，混匀，煮沸5min,12000r/min离心2min，取上清10上样，同时设标准蛋白对照孔恒压130V电泳1~1.5h,电泳完毕后用适量染色液浸泡凝胶染色30~45min脱色液脱色2~4h,其间更换新的脱色液，直至条带清晰，观察SDS-PAGE电泳后，包涵体中目的蛋白的分离情况SDS-PAGE电泳完成后，取出凝胶直接置于100mmol/L的KCI溶液中4°C浸泡2h电泳条带清晰时参照标准蛋白从凝胶上切下表达产物所处的条带，装入透析袋中加适量的pH7.2的PB缓冲液，恒压30V电泳30min收集电洗脱液，即纯化的目的重组蛋白用紫外分光光度计测定样品在波长260nm和280nm时的光吸收值，按下式计算样品中的蛋白质含量：蛋白质浓度(mg/mL)=(1.45XA280—0.74XA260)X稀释倍数分装后，-20C保存备用。