2022年蛋白质的性质与分离、纯化、鉴定.docx

蛋白质的性质与别离' 纯化' 鉴定 一、蛋白质的酸碱性质蛋白质也是一类两性电解质，能和酸、碱发生作用在蛋白质分子中，可解离基团主要是侧链基团，及少数N端-NH2 和 C 端-COOHP197 范表 376天然球状蛋白质的可解离基团大局部可被滴定，而某些天然蛋 白质中有一局部可解离基因由于埋藏在分子内部或参与氢键形成 而不能解离1、等电点和等离子点〔中性盐点2+、Mg2+、cL HP042++)等电点：P198 范表 3-17 3-18蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基 的比例有关等离子点：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出的质子 数与质子受体结合的质子数相等时的pH值称等离子点，是每种蛋 白质的特征常数在等电点条件下，蛋白质的电导性' 溶化度最小，粘度最大2、蛋白质的电泳别离聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGESDS-PAGE〔荷质比相同，分子量不同〕3、离子交换层析别离蛋白质与氨基酸别离原理相似二、蛋白质的大小与形状测分子量的方法：化学组成法凝胶过滤法SDS-PAGE 法三' 胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通 性〔布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜〕透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋中，置水溶液中，小 分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。

蛋白质在水中溶化度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对极 性，离子化基因数量越多，溶化度越大1、稳定蛋白质胶体溶液的主要因素①蛋白质范外表极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开， 不会相互碰撞凝聚而沉淀②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，相互排斥不致聚集而 沉淀一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液中 析出沉淀2、沉淀蛋白质的方法①盐析法 向蛋白质溶液中参加大量的中性盐〔NH4〕2s04、Na2s04、NacU,使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀②有机溶剂沉淀法破坏水化膜，降低介电常数③重金属盐沉淀pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子〔Hg2+.Pb2+. Cu2+等〕结成不溶性沉淀④生物碱试剂和某些酸类沉淀法pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离 子生成不溶性沉淀生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸' 苦味 酸、 铝酸酸 类：三氯乙酸' 磺基水杨酸⑤加热变性沉淀往往是不可逆的四' 蛋白质的变性变性作用：理、化因素影响，使蛋白质生物活性丧失，溶化度下 降，不对称性增大及其它理化常数改变〔1〕变性的因素：□ □盐浓度、盐析、盐溶；□-硫基乙醇；P复原性试剂：尿素、□去污剂、去污剂都是两亲分子，破坏疏水作用；口有机溶剂， 破坏疏水作用；口强酸和强碱；口温度；［重金属离子，Hg2+、 pb2+,能与-SH或带电基团反响。

机械力：如搅拌和研磨中的气泡〔2〕变性的实质:次级键〔有时包含二硫键〕被破坏，天然构象解体变性不汲及 一级结构的破坏〔3〕蛋白质变性后，往往出现以下现象：①结晶及生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征②硫水侧链基团外露③理化性质改变，溶化度降低、 沉淀，粘度增加，分子伸展④生理化学性质改变分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解实际应用：A.消毒灭菌：75%乙醇，紫外线，高温B.制备活性蛋白质时严防蛋白质变性〔4〕变性机理①热变性〔往往是不可逆的〕多肽链受到过分的热振荡，引起氢 链破坏②酸碱变性：破坏了盐链③有机溶剂：破坏水化膜，降低蛋白质溶液介电常数〔5〕可逆变性与不可逆变性有人认为：二级、三级或四级结构受到被破坏即为变性，三级 〔或四级〕结构被破坏时引起可逆变性，而二级及三级〔或四级〕结构一并遭破坏时引起不可逆变性五、别离纯化蛋白质的主要方法实质：①蛋白与非蛋白分开，②蛋白质之间分开原理：1 .溶化度差异PEG沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法2 .热稳定性差异热处理沉淀法铜锌SOD〔65℃、15分钟' 稳定〕3 .电荷性质差异离子交换层析法电泳法4 .分子大小和形状差异凝胶过滤、超滤法透析法、离心法5 .亲和力的差异亲和层析法某种蛋白质能与一种配基特异而非共价结合。

配基是指能被生物大分子识别并与之结合的原子' 原子团和分 子，如酶的底物、辅酶、调节效应物及其结构类似物，激素与受 体蛋白' 抗原与抗体别离原理：P224 图 37 24蛋白质毒素u□干扰细胞内机能；口破坏细胞膜；口一些致病生物产生的毒素中 有很多是蛋白质毒性机理有：抑制神经细胞突触的功能直接作用于细胞膜的毒素称溶细胞毒素，可以由细菌、真菌、植 物、 鱼、蛇等产生链球菌属(Streptoccus) Pyogene产生的链球 菌溶血素(包含0.5等)，能使精细胞产生孔洞，Na+等离子外渗， 细胞死亡链球菌溶血素0是产生风湿热的原因之一(rhe i emat ie fever) o此外，一些有毒的酶点，如蛇的磷酯酶在A2也能破坏细 胞膜破坏细胞内机能的毒素也很多，如白候杆菌(Corynebacter i ad i phther i ae)产生的白候毒素(d i phther i a tox i n)和霍乱弧菌(Vibrio cho I erae)产生的霍乱毒素(cho I era toxin)o它们均由A、B两个亚基组成，B亚基与靶细胞结合，A 亚基致毒白候毒素分子一旦进入靶细胞，AB亚在就分开，A亚 基是一种酶能阻挡蛋白质的合成，寄主的心、肾和神经组织都会 被破坏。

霍乱毒素的B亚基由5个相同亚基组成，B亚基与肠细胞膜结 合，A亚基就被送入这些细胞中，A亚基激活一种酶使cAMP大量 产生，cAMP翻开细胞膜的CL通道，由于CL-外泄引起渗适压的改变，水分也大量丧失，结果导致腹泻(diarrhoea),不加医治的 话，严峻的脱水可使病人48小时内死亡Latrotoxi n (125KD)是一条多肽链，能剌激神经递质乙酰胆碱 (acetyl cho I ine, a神经突触连接两个神经元或一个神经元与一个 肌肉细胞一种毒蜕的产生的毒素ACH)的广谱性释放酶肉毒杆 菌(Lostr I d i um botu I i num)产生的肉毒杆菌毒素(botu I i num toxin)能抑制Ach释放酶肉毒中毒(botuI i sm)为是由于受了被污 染的罐袋食物引起的第六章核酸 核酸是遗传物质1868年瑞士 Miesher.从脓细胞的细胞核中别离出可溶于碱而不溶 于稀酸的酸性物质间接证据：同一种生物的不同种类的不同生长期的细胞，DNA含量 根本恒定直接证据：T2噬菌体DNA感染E.coli用35s标记噬菌体蛋白质，感染E.coli,又用32P标记噬菌体核 酸，感染E. col iDNA、RNA的分布〔DNA在核内，RNA在核外〕。

第一节核酸的化学组成核酸是一种线形多聚核昔酸，根本组成单位是核昔酸结构层次： 核酸核昔酸核昔磷酸戊糖碱基组成核酸的戊糖有两种：：D-核糖和D-2-脱氧核糖，据此，可以将核酸分为两种：核糖核酸〔RNA〕和脱氧核糖核酸〔DNA〕P330范表5-1两类核酸的根本化学组成一、碱基1 .喋吟碱： 腺噂吟 鸟口票吟2 .喀咤碱：胞喀喔尿喀喔胸腺喀咤P331结构式3 .修饰碱基植物中有大量5-甲基胞喀喔E.coli噬菌体中，5-羟甲基胞喀口定替代C稀有碱基：100余种，多数是甲基化的产物DNA由A、G、C、T碱基构成RNA由A、G、C、U碱基构成二、核昔核昔由戊糖和碱基缩合而成，糖环上C1与喀喔碱的N1或与喋口令碱的N9连接核酸中的核昔均为B-型核昔P332结构式腺口票岭核昔胞喀喔脱氧核昔DNA的戊糖是：脱氧核糖RNA的戊糖是：核糖三、核昔酸核昔中戊糖C3、C5羟基被磷酸酯化，生成核昔酸1、构成DNA、RNA的核甘酸P333 范表 5-32、细胞内游离核苦酸及其衍生物①核昔5, -多磷酸化合物ATP、 GTP、 CTP、 ppppAv ppppG在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用②环核昔酸cAMP C 3* , 5' -cAMP] cGMP〔3' , 5' -cGMP ]它们作为质膜的激素的第二信使起作用，cAMP调节细胞的糖代 谢、脂代谢。

③核昔5‘多磷酸3,多磷酸化合物PpGpp pppGpp ppApp④核昔酸衍生物HSCoAv NAD+、NADP+、FAD 等辅助因子GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体o 第二节DNA的结构一级：脱氧核昔酸分子间连接方法及排列顺序二级：DNA的两条多聚核甘酸链间通过氢键形成的双螺旋结构三级：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象一、DNA的一级结构DNA的一级结构是4种脱氧核昔酸（dAMPv dGMP、dCMP、dTMPj通 过3/、5/-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体3/、5/-磷酸二酯 键是DNA、RNA的主链结构P334 图 5-1书写方法：5/ T 3/：5' -pApCpTpG-3,,或 5'…ACTG…3'〔在 DNA 中，3/-0H 一般 是游离的〕在DNA分子中，不变的骨架成分磷酸二酯键被逐渐省略，真正代 范表DNA生物学意义的是碱基的排列顺序遗传信息贮存在DNA的碱基排列顺序中，生物界生物的多样性即 寓于DNA分子4种核昔酸千变万化的X的排列顺序中二、DNA的二级结构1953年，Watson和Crick依据Chargaff规律和DNA Na盐纤维的 X光衍射数据提出了 DNA的双螺旋结构模型。

1、Watson-Cr i ck双螺旋结构建立的依据①Char gaff规律1950年a.全部 DNA 中，A=T, G=C 且 A+G=C+TP334 范表 5—4ob. DNA的碱基组成具有种的特异性，即不同生物的DNA皆有自己独特的碱基组成C. DNA碱基组成没有组织和器官的特异性d.年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成②DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射分析相对湿度92%, DNA钠盐结晶，B—DNAo相对湿度75%, DNA钠盐结晶，A—DNAoZ—DNAo生物体内DNA均为B—DNAoFrank I i n的工作2、Watson-Cr i ck双螺旋结构模型P335 图 5—2a.两条反平行的多核苦酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双 股螺旋，一条5' T3',另一条3' T5'b.d票吟与喀喔碱位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在外侧磷 酸与脱氧核糖彼此通过3/、5/-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子 的骨架宽 1.2 nm 宽 0. 6nm大沟 小沟深 0. 85nm 深 0. 75nmc.螺旋平均直径2nm每圈螺旋含10个核甘酸碱基堆积距离：0. 34nm螺距：3. 4nmd.两条核昔酸链，依靠彼此碱基间形成的氢链结合在一起。

碱基 平面垂直于螺旋轴A=T、G=CP336 图 5—4碱基互补原则具有极重要的生物学意义，DNA的复制、转录、 反转录等的分子根底都是碱基互补3、稳定双螺旋结构的因素①碱基堆积力〔主要因素〕形成疏水环境②碱基配对的氢键GC含量越多，越稳。