哺乳动物胚胎冷冻保存.doc

摘 要:哺乳动物胚胎冷冻保存效果受从稀释液和冷冻保护剂、冷冻前处理、冷冻剂型、 冷冻速率、解冻等方面的因素其中冷冻方法是一个关键性因素目前胚胎冷冻方法主要 有常规慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两种常规慢速冷冻法是指利用甘油、乙二醇等做冷冻 保护剂通过缓慢降温的方式进行胚胎冷冻;玻璃化冷冻法是指利用高浓度的冷冻保护剂通过 快速降温的方式进行胚胎冷冻与常规慢速冷冻法相比,玻璃化冷冻法简化了操作过程,大大 缩短了操作时间,不需昂贵的程序控制冷冻仪关键词:胚胎;冷冻保存;冷冻保护剂;冷冻;解冻,玻璃化胚胎冷冻保存[1]是指通过特殊的保护措施和降温程序,使胚胎在-196℃条件下停止代谢,而升 温后又恢复代谢能力的一种技术一般指 0～-80℃的温度下保存胚胎,而超低温冷冻保存则 是在极低的温度(液氮-196℃、液氦-269℃)下保存动物胚胎.处于超低温下的胚胎,其新陈代 谢几乎完全暂时停止,因而可以达到长期保存的目的[2]1972 年 Whittingham[3，4，5]等首 次在超低温条件下成功地冷冻保存了小鼠胚胎, 解冻后移植产下后代由于这种方法的诞 生引来了很多的人的注意，此后,许多学者对哺乳动物胚胎冷冻保存进行了大量的研究,取得 了大量研究成果, 牛(Wilmut ②在-5℃~-9℃之 间植冰;③以 0.3℃~0.6℃/分的速度缓慢降温;④降温到-30℃~-40℃之间,投入液氮中保存; ⑤以 250℃/min 的速度快速解冻;⑥在培养或移植前,室温下除去冷冻保护剂 分段慢速降温在哺乳动物胚胎的冷冻保存中常用,大都获得了成功。

Zhang 等(1989)在进行 鲤鱼胚胎的冷冻保存时也采用了这种降温模式,获得了液氮中保存的鲤鱼胚(陈松林 2002) 胎有 25%复活并孵出鱼苗的成功实例张克俭等(1997)对泥鳅等 3 种淡水鱼胚胎进行的冷 冻保存实验表明,分段快速降温好于分段慢速降温Guo 等(1994)在研究牡蛎胚胎的冷冻保 存时,认为 1.5℃/min 的降温速率效果最好 2.2 分段快速冷冻法 为目前最成熟的方法与一步法相比，虽然操作比较繁杂，需要专门的冷冻仪，但胚胎解 冻后存活率及移植成功率较高，为目前生产中最常用的方法，其具体操作步骤如下：(1)胚胎的采集及洗涤 用手术法或非手术法采集胚胎后，选择形态正常的桑椹胚或囊胚 在含 20％犊牛血清的 PBS 中洗涤两次2)加入冷冻液 洗涤过的胚胎在室温条件下加入含 1.4M 甘油的冷冻液中平衡 20 分钟3)装管和标记 按图 10-8 类似的装管方法将胚胎和冷冻液装入 0.25ml 细管中，封口，并 在细管外标记供体号，胚胎数量，等级，冷冻日期等4)冷冻和诱发结晶(植冰) 将装入细管的胚胎放人冷冻仪中，在 0℃平衡 10 分钟，以 1℃ ／分的速度降至-6～-7℃，在此温度下诱发结晶，并平衡 10 分钟。

然后以 0.3℃／分的速 度降温至-35～-38℃，投入液氮保存5)解冻和脱除保护剂从液氮中取出装胚胎的细管，立即投入 37℃水浴中，并轻轻摆动， 1 分钟后取出即完成解冻过程然后用 0.2～0.5M 蔗糖 PBS 液分两步或一步法脱除冷冻保 护剂使胚胎复水，最后移入 PBS 培养液中准备移植此外，目前研究的细管内一步解冻方法，选用乙二醇等对胚胎无毒害作用的保护液，装 管时含有胚胎的保护液占 1 份，两端的 PBS 液共占 3 份按快速法冷冻解冻后，在细管内 直接脱除或不脱除保护剂即可直接移植该方法简化了程序，便于胚胎移植推广，但有待 改进提高妊娠率其与分段慢速降温的主要差别就是从 0℃~-60℃,采用 2~5℃/min 的降温 速率 2.3 玻璃化冷冻 玻璃化(vitrification)是指利用物理学原理将高浓度的抗冻保护剂急速降温后,由液态转化为 外形类似玻璃状的稳定而透明的非晶体化固体状态的过程[10]它的主要特点是使用冷冻 和解冻速率均较快的高浓度的低温保护剂、操作简单、不需要昂贵的设备玻璃化冷冻不 要求严格的降温速度,就方法而言,最不利的因素就是高浓度的冷冻液对胚胎造成的毒害作用,所 以胚胎暴露在冷冻液的时间应严格控制在一定范围之内。

这种方法采用快速降温和高浓度 的冷冻保护剂,使冷冻过程中溶液变得十分黏稠和坚固,不形成冰晶伤害从而在这到冷冻保 存从 1985 年 Rally 和 Fahy 首次用玻璃化法冷冻小鼠胚胎获得成功,玻璃化冷冻技术就成 为学者们的研究热点之后玻璃化冷冻保存不断改进目前,玻璃化冷冻技术不仅能成功地 冷冻保存多种哺乳动物的胚胎,而且还能冷冻保存对低温敏感性高的卵母细胞2.3.1 冷冻保存原理[11] 胚胎低温冷冻保存实际上是一个脱水过程,冷冻保存最关键的是设法减少细胞内冰晶所致的 损伤所以冷冻速度和冷冻保护剂是影响玻璃化冷冻保存的两个关键因素要在一定的冷 冻速度下形成玻璃化状态,就需要高浓度的冷冻保护剂,但是浓度过高的冷冻保护剂又会对胚 胎产生毒害不同种冷冻保护剂形成玻璃化的能力和对胚胎的毒性也不一样因此寻找毒 性低、形成玻璃化能力强的玻璃化冷冻液成为胚胎玻璃化冷冻研究的热点之一大量研究 表明提高冷冻速度能有效的降低冷冻剂对胚胎的毒性作用，同时把不同种类的冷冻保护剂 组合成玻璃化冷冻液,也能达到降低冷冻保护剂对胚胎毒害作用,提高玻璃化冷冻效果的目的 冷冻过和中标本降到一定温度时,首先在细胞外溶液形成冰晶,而细胞尚未结冰,处于超冷状 态。

随着细胞外液冰晶逐渐增大,细胞外液的渗透压升高,具有较高的化学能如果冷冻速度 很慢,细胞膜两侧的渗透压差和化学能差导致细胞质水分跨膜向细胞外渗透引起细胞内进行 性脱水,因此细胞内不能形成冰晶相反,如果冷冻速度过快,细胞内水分不能及时渗出,而在 细胞内形成冰晶,胞浆内结冰过多会破坏细胞器,刺破细胞膜,导致细胞死亡通过冻前在稀 释液中加入一定浓度的低温保护剂,让细胞在保护剂中平衡并适当脱水,可将损伤降到最低限 度胚胎在冷冻过程中,大约在-10℃以上细胞内不结冰,但处于过冷状态的胞质产生溶液效 应和细胞内外化学势差异,导致胞质水分在胞内和胞外冻结,这两情况谁占优势对细胞存活尤 为重要在温度降到-10℃以下,过冷胞质就形成冰晶,胚胎在冷冻过程和解冻过程中两通过 易形成冰晶的危险温区(-15~-50℃),所以采用适当的冷冻方法和低温保护剂,使胚胎安全通过 危险区很重要将胚胎在冷冻前进行处理,向保存液中加入保护剂如甘油和蔗糖,可以改变细 胞膜渗透性和溶液渗透性,防止溶液效应和渗透压差异,减少降温和复温过程中冰晶的形成 玻璃化冷冻保存胚胎时,其高浓度的渗透性保护剂组成的玻璃化液是一种黏稠的玻璃态物质, 低温时它不结晶就可固化。

胚胎在这种溶液中脱水一定程度,可引起内源性大分子和已渗入 的保护剂浓缩,从而使细胞在急剧降温过程中得以保护但无论怎么样的方法只有在最大冷 冻速度和最大冷冻保存浓度上达到一个平衡才能达达理想的冷冻保存目的 2.3.2 玻璃化溶液中的处理过程 2.3.2.1 一步法 玻璃化冷冻胚胎最简单的方法是将胚胎从生理溶液中直接移入玻璃化溶液中去,然后将其投 入液氮保存一步法具备时间短的优势,但为了防止胚胎细胞内冰晶的形成,抗冻保护剂必须充分渗透于胚胎细胞内部而且,抗冻保护剂的渗透和它的毒性很大程度上受温度的影响,最 适的处理时间和温度是相关的在较低温度下处理时间可延长,较高温度下可缩短例如,小 鼠桑椹胚依靠 EG 为基础的玻璃化溶液,在 5℃时处理 2~10 m in,在 20℃时处理 30 s~5 m in, 在 25℃时处理 30 s~1 min 均可获得较高的存活率因此,一步法玻璃化冷冻胚胎选择渗透性 强的抗冻保护剂,缩短保护时间优于选择低毒性抗冻保护剂,延长处理时间的方法 2.3.2.2 分步法 溶液浓度高对胚胎的毒性大,采用分步平衡法可获得较高的冷冻效果胚胎首先在含有低浓 度抗冻保护剂的溶液中平衡而不会导致毒性损伤,然后在玻璃化溶液中平衡较短时间即投入 液氮,这样对胚胎的毒性损伤较低。

Rall 等玻璃化冷冻法是将胚胎在玻璃化溶液中平衡时,溶 液由低到高(25% ~50% ~100% )分 3 步完成的Scheffen 等用 2 步平衡法冷冻小鼠 8-细胞至 桑椹胚,存活率为 77% ~91%Zhu 等将胚胎在 10% Gly 溶液中平衡 5 m in,再移入 GFS 玻璃 化溶液中平衡 30 s,随即投入液氮的 2 步法冷冻程序,解冻后小鼠扩张囊胚存活率达到 92% 2.3.3 玻璃化冷冻保存的方法 2.3.3.1 细管法 细管法是将胚胎置于 0. 25 mL 细管中直接投入液氮的方法细管法的装配过程极为严格,其 操作程序如下:在细管中顺序吸入 0. 5 mol/L 蔗糖 5. 5 cm、空气 1. 5 cm、冷冻液 0. 5 cm、 空气 0. 5 cm、冷冻液 1. 5 cm 后,将胚胎移入冷冻液 1. 5 cm 段中,接着顺序吸入空气 0. 5 cm、冷冻液 0. 5 cm,最后吸满蔗糖液,封口后直接投入液氮中冷冻保存解冻时,将细管在与 冷冻时相同温度的水浴中升温至蔗糖液段由乳白色变为透明为止,剪去细管二端栓塞,将其内 容物冲洗到含有 0. 5 mol/L 蔗糖液的表皿中,在实体显微镜下检出胚胎并按程序脱出抗冻保 护剂。

朱士恩等用 2 步细管法冷冻兔扩张囊胚得到 89% ~90%的发育率,妊娠率 29. 2%丁 家桐等采用此法在研究山羊胚胎冻存中得到妊娠率、产羔率分别为 61. 5%和 40. 0%,液氮中 保存 3. 0~4. 5 年的山羊桑椹胚、囊胚解冻后发育率分别为 38. 6%和 47. 6% 2..3.3.2 OPS 法 OPS 法是将 0. 25 mL 细管加热变软后拉制而成的管壁厚度约为 0. 07 mm,内径为约 0. 8 mm 的开放式拉长细管冷冻时将胚胎由细小端吸入 OPS,然后直接投入液氮保存解冻时,将 OPS 细小端浸入解冻液后,吹出 OPS 内容物,在实体显微镜下收集胚胎并按程序脱出抗冻保 护剂应用此法,潭鸿明等用 EFS30 冷冻小鼠 2 -细胞胚胎,囊胚发育率高达 62. 2%朱士恩 等[7]用 EFS 和 EDFS 对小鼠原核胚进行玻璃化冷冻保存,各冷冻组的原核正常率为 95% ~100%,体外发育率为 76% ~82% 2.3.3.3 微滴法 如果将含有胚胎的冷冻液直接滴入液氮,冷冻速率将会得到极大提高,这便产生了微滴法在 冷冻过程中,将含有胚胎的体积约为 6μL 的冷冻液小滴直接滴入液氮中,然后用镊子对冷冻 液形成的颗粒集中到小管中保存。

解冻时将冷冻颗粒直接投入解冻液中,颗粒融化后收集胚 胎并按程序脱出抗冻保护剂朱士恩等[8]用微滴法冷冻保存小鼠扩张囊胚,解冻后的存活率 达 100%,移植后产仔率达 71% 2.3.3.4 微细管法 玻璃微细管法是将毛细玻璃管拉制成直径 0. 3 mm 微细管,类似于 OPS 管的方法冷冻胚胎 Kang 等[9]用此保存小鼠囊胚,其效果和 OPS 法无显著差异玻璃微细管的导温性能好于 OPS 管,能提高冷冻解冻时的变温速率但在超低温下,玻璃微细管容易断裂,造成胚胎丢失2.3.3.5 冷环玻璃化法(Cryoloop 法)[12] 冷环玻璃化法就是将胚胎在低浓度冷冻液中处理,然后将胚胎移到附有玻璃化液的尼龙膜环 (直径 0.5~0.7mm)上,将环投入浸在液氮中的冷冻管内[3]胚胎从接触玻璃化液到投入液氮的时间为 20~30s,Cryoloop 法具有与开放式拉管法(OPS 法)相似的降温速度快的优点 Cryoloop 法最先在小鼠和人囊胚上应用[5],采用 Cryoloop 法冷冻的人囊胚移植后已成功产 出婴儿[6]目前,已用 Cryoloop 法成功地冷冻保存了马(N.Oberstein et al,2001)、猕猴 (RR.Yeoman et al,2001)的。