红曲霉生产洛伐他汀的技术发展.docx

红曲霉发酵生产Monacolin K的工程技术研究进展摘 要：红曲的药用价值和保健功效日益引人关注，其中洛伐他汀作为红曲主要的调脂因子 成为科研热点和红曲产业发展的重点概述红曲洛伐他汀的发现、用途、生产方法、提纯 检测方法、毒性物质问题以及生产现状进行综述 关键词:红曲霉、洛伐他汀、检测、提取、桔霉素1. 前言1.1 Monacolin K 的发现及结构式Monacolin K 是目前较好的降低人体血液中胆固醇的药剂,具有降胆醇、降血脂的作用, 又叫洛伐他汀(lovastatin)，存在于红曲霉及其它真菌如Pleurotus, Phoma, penicillium中生 产所使用的菌种主要有两类:红曲霉和土曲霉,东方国家如日本及我国多采用红曲霉 ,欧美等 国的研究多采用土曲霉川，最近几年，美国也开始意识到中国食品红曲中的药用价值其结构 式为：分子式为C24H3605,Mr为4041979年，日本学者远藤章首先从红色红曲霉菌Monascus24 36 5ruber 中发现某些能产生强力抑制胆固醇合成的活性物质,命名为 Monacolin K, Monacolin K 类物质不仅可以降低胆固醇,而且对重症胆固醇血症患者也极为有效,特别是对导致动脉硬化 最严重的低密度蛋白胆固醇有优先降低的作用,其中以Monacolin K抑制HMG — COA还原 酶的活性最高川。

1980年，美国Albert等从土曲霉中发现了与Monacolin K相同的物质侧，命 名为mevinolin,现称作洛伐他汀(Lovastatin)但是采用土曲霉发酵，菌株的安全性对下游工程 的技术要求较高，因此提取收率较低由药用红曲霉制成的制剂具有较强的降血脂能力，副作 用较低于Lovastatin制剂近些年来,我国开展了红曲霉降血脂生理活性物质的研究1.2 Monacolin K的基本性状见表1丧? Mor讪加itiK舵吐■本件狀鐵外线光讲肚忙肯比愎：涪鞘性示啟大血昏 卩心戶％小熔点比 妙卩勢出」溶解于甲磐, 乙S5,丙醇,22乩胡,西6 国亠⑶ 0.47 氮仿及泪厲不瞎于正己 烷仪右池嚣1.3 Monacolin K抑制胆固醇合成的作用机理生物化学的研究表明,胆固醇合成的关键步骤是甲经戊酸的合成（见结构式）2CH； COCoA- -——^COCHs COCOACH5 COCoA HMGCOAT合成噩ch2I \£原酶 I/ 、、 -- HO-C-CiI,2XA1.V1 2XA 打F+H亠 厂"COCdA其中影响最大的是3 一羟基一 3甲基一戊二酰CoA〔HMG — CoA〕还原酶，它是胆固 醇合成代谢中的限速酶,各种因素对胆固醇合成的调节主要是通过对 HMCCoA 还原酶活性 的影响来实现的。

Monacolin K的空间结构与HMG — CoA的结构非常相似，且对HMG 一 CoA还原酶的亲和力比HMG — CoA强1万倍,所以它能竟争性地与IIMG 一 CoA还原酶结 合,从而抑制胆固醇合成这类物质的浓度只要达到0.001 一 0.005yg/m 1,胆固醇的合成就会 受阻，即人体血液中含有MOnacolin K在1 一 5gg/L时会产生降低胆固醇功效阁成年人血 液量为20L,所需Monacolin K有效剂量为100聘,若菌株MonacolinK发酵液含量为47.1卩g/ml, 服用3而发酵液即可满足要求［1］2. 功能红曲的生产方法2.1 固态发酵传统红曲生产工艺主要是以大米为固态培养基，接种红曲菌菌种后通过发酵生产红曲 该方法工艺落后，劳动强度大，红曲产量低，质量不稳定，并且易受杂菌污染 80 年代后， 通风池法应用于红曲的生产，红曲产量和质量相对提高圆盘制曲机的应用实现了红曲的自 动化生产，并提高了红曲质量，在一定程度上减少了杂菌污染传统红曲发酵工艺由于未能有效控制通风、温度、湿度等重要发酵条件，因此，所得红 曲的色价和活性成分较低，且桔霉素污染严重刘昕 ［2］提出在固态发酵中，代谢产物Monacolin K 在红曲菌菌丝体生长后期的积累达到最大。

同时，由于淀粉质固态培养基料被 红曲菌分泌的淀粉酶和糖化酶液化而出现基料通气环境恶化，菌丝体细胞壁被高渗透压葡萄 糖液浸润，从而使其生长代谢出现变态反应，促使桔霉素的生成以抑制其它杂菌的生长因 此他提出了一种通过调控红曲菌培养过程中的培养温度、湿度及通风量来抑制桔霉素生成的 方法，所获得的功能性红曲中 Monacolin K 含量高且未检测出桔霉素王立新等［3］认为固态发酵法较液体发酵法具有明显的优势在确定的实验条件下，固态 发酵法所得的 Monacolin K 产率为液体发酵法的 20 倍以上因此在掌握固态发酵规律的 基础上，设计合理的固态发酵反应系统，实现高效低耗的固态发酵生产，是功能性红曲产业 化生产的有效途径同时，该研究表明固态发酵过程中物料的初始含水量以 50%为宜含 水量较高时，糖化酶活性增强，从而提高培养基料的糖化速率，不利于红曲中Monacolin K 的积累培养温度对促进红曲菌发酵过程中 Monacolin K 的生成十分重要恒温培养可获得比 变温培养更高收率的菌体量和色素，而变温培养的 Monacolin K 产量更高实验研究表明， 在32°C温度下培养9 d后，将温度降至25°C下培养14 d,则更有利于Monacolin K的 积累［4］。

红曲为好气性菌，其菌丝体的生长和Monacolin K等次生代谢产物的产生都需要有足够 的氧气因此，适宜的溶解氧水平是一个非常重要的参数，它直接影响红曲中Monacolin K 和桔霉素的含量提高通风量有利于菌体生成和 Monacolin K 的产生，但同时桔霉素的含 量也增加因此，在满足溶氧需求的情况下，可采用低通风量［5］固态发酵法是目前红曲生产中广泛采用的方法，具有投资少，产量大，生产经验丰富等 优点现代固态发酵工艺的关键是控制发酵过程中菌种质量及物料含水量、通风量、培养温 度及湿度等参数，通过现代技术优化和改造发酵工艺，可望有效生产富含活性成分 Monacolin K 且不含桔霉素的功能性红曲2.2 液态发酵液态发酵法发酵红曲主要以淀粉、葡萄糖、甘油、黄豆粉、玉米浆和蛋白胨等为培养基， 采用常规标准深层发酵设备，如机械搅拌发酵罐等近年来开发的适宜于高粘度发酵体系的 气升式反应器，将更加有利于发酵过程的进行液态发酵法培养基的碳源、氮源、初始 pH 值及溶氧量等是关键的工艺控制参数碳 源以甘油最好，葡萄糖次之有机氮源中肉膏和蛋白胨优于酵母膏，无机氮源则以 NaNO3 较好 C/N 比值是十分重要的控制因素，它不仅影响前期菌丝体的生长，而且对后期代谢 产物的形成和积累也非常重要。

实验结果表明，当 C/N 比为 5:33 时， Monacolin K 的产 量较高⑹赵树欣等⑷认为培养基的初始pH值对Monacolin K的生成也有明显影响，当pH 为 6.0~6.5 时最为适宜许赣荣等［7］对经过筛选低产桔霉素的一株红曲菌菌种进行液态发酵法培养，选用玉米淀 粉和谷氨酸单钠盐为主要成分的培养液，所获得的红曲菌发酵液中桔霉素浓度低于 1mg/ml 此外，溶氧条件对红曲菌产生桔霉素的影响的研究结果表明，高溶氧对桔霉素的 产生有促进作用Blanc 等［8］研究发现，在液态深层培养红曲的过程中添加 6 至 18 碳脂肪酸和甲基酮会 影响红曲中桔霉素的生成，尤其是辛酸和 2-三十碳酮可使桔霉素的生成量减少 75%杨胜利等［9］研究发现，应用超声波技术可提高红曲菌发酵过程中 Monacolin K 的产量 正常情况下红曲菌落呈团状，氧和营养物质不易吸收，也不利于代谢产物的生成采用超声 波处理可使菌丝体分散，甚至成为游离的单菌体，从而有利于菌体的代谢和活性物质的分泌 同时，超声波处理还可降低发酵液的粘度，有利于氧气和营养物质的传递实验结果显示， 当超声处理时间为 2 min 左右时其效果最佳，既不引起细胞死亡，又能显著提高 Monacolin K 的产量。

液态发酵法所用基质的混合和扩散较为均匀，有利于氧气和其它营养成分的传递与扩散 且易于添加某些特定成分以抑制桔霉素的生成但目前国内采用液态深层发酵法生产的红曲 发酵液中， Monacolin K 含量较低且不稳定，甚至出现依靠添加由土霉素发酵获得的 Monacolin K 或直接添加合成药物洛伐他丁来控制产量的现象因此，红曲的液态发酵工艺 及产品质量控制需进一步加以规范3 提取工艺国际上对洛伐他汀的首次报道来自A.Endo. 1976年,东京大学酵实验室的Akira Endo从 泰国食品中分离出来Monascus菌株(Monascus-rubberNo.1005),经发酵产生洛伐他汀.其培养 基组成为:6%葡萄糖、2.5%蛋白胨、0.5%玉米油、0.5%氯化氨.经28e需氧培养10 d,所得发 酵液经处理可得到无色的洛伐他汀晶体.其提取工艺见图1.发醉戕上淸液厶m 乙阳捉取沪也油狀段l也』去L水相且3J有机村竺辿★-机宀空沁皿汕状汩伐他嵌晶亠竺无养伐他汀晶休图 1 最早的洛伐他汀提取工艺 但该工艺多次采取溶媒萃取法,并大量使用有害溶媒,对劳动者及环境都会造成极大危害 王健［10］等通过实验研究确定了从洛伐他汀发酵液中提取洛伐他汀的最佳工艺条件。

实 验表明乙醇作为溶剂时，其最佳工艺条件：浸提温度45°C，物料比5 : 1（乙醇/mL :菌丝 /g）,浸提时间4h,闭环温度80C，闭环时间5h本工艺简便、收率高，适用于工业化生 产周慧［11］等提出了采用超临界 CO2 流体萃取， 95％乙醇超声洗涤纯化的方法通过实验 确定优化萃取工艺为萃取压力25 MPa、萃取温度55 C、夹带剂用量2.0 mL・g-】、萃取时间 100 min；优化纯化工艺为95%乙醇为洗涤溶剂，洗涤4次，每次用量2 mL・g-打所得洛伐 他汀纯度〉98%该方法的优势在于摒弃了大量有机溶媒，仅使用乙醇一种溶剂，不会对人 体及环境造成危害；工艺简便，省去了结晶与重结晶步骤；降低了成本，适合工业化生产的 需求4 洛伐他汀分析检测方法4・1硅胶薄层层析法测定（TLC）毛宁等［12］通过实验发现，若用发酵滤液粗提浓缩物， 最终提取结晶以及结晶剩下的滤 液点样，用薄层层析检测 结果几乎一致，因此只需对发酵滤液粗提的浓缩物进行薄 层层析 定量或定性检测TLC定性试验：取硅胶GH25420g,加0.5%CMC Na50m 1,用铺板器铺成1mm厚， 20cmx20cm的薄层板，室 温晾干，105C活化1h,置干燥器中备用。

展开剂：二氯甲烷： 丙酮（9： 1）,称取固态样品5g,用100ml乙酸乙酯在索氏提 取器上回流提取1h,提取液 浓缩至5ml,取50卩1点样，或直接取发酵滤液粗提浓缩物50卩1点样，同时用Monacolin K 标准品（美国Merch公司）点样作对照，展开15cm,取出晾干,紫外灯下观察斑点位置 Monacolin KRf值应为0.47,分 别挖取与标准品相同Rf值的斑点和相同面积的空白硅胶作 参照，置10ml具塞试管中，加乙酸乙酯5ml,剧烈振荡2min, 2000r/min离心15min,取 上清液低温蒸干，加5ml环已烷重新溶解，观察在200〜300nm范围内的紫外吸收图谱， Monacolin K 在 231nm， 238nm 及 247nm 下有特征吸收峰TLC定量分析：精密称取标样适量，加乙酸乙酯配成1ml含10mg的溶液，精密吸取 该液5, 10, 15, 20, 25卩1点于薄层板上，展开，分别刮取Monacolin K斑点和相同面积 的空白硅胶，按以上制成环乙烷溶液。