感染性疾病病原如何精准诊断.docx

感染性疾病病原如何精准诊断对每一位感染性疾病的患者来说，治疗尤为重要而对于每一位临床医生来 说，对感染的精准有效治疗，首要考虑的就是确定造成疾病的病原体面对纷繁复 杂、多种多样的检测手段，在精准医疗的时代，我们应该何去何从？病原诊断的金标准一一培养？培养！1983年4月，研究人员从血液中别离出的第一株肺炎链球菌，为研究肺炎链球 菌的世界分布做出了卓越的贡献光阴荏苒，从1983年到现在，多种多样的方法：涂片镜检、抗原诊断、抗体、 病理、分子生物学等方法，已经越来越多地走向临床，作为快速便捷的诊断方法被 广为使用对宿主反响模式的检测也成为我们的诊断感染病的方法之一反观病原 培养，阳性率较低，仅10%~30%且需要较长的培养时间，如结核分枝杆菌需要长达 45天但即便如此，刘钢教授指出“无菌部位病原体培养，依然是诊断感染相关疾 病的金标准不容忽视的新生力量一一基因测序近几年，精准医学在病原诊断方面也势头渐起从1995年完成第一株流感嗜血 杆菌全基因组测序后，当代医学对病原的基因研究如雨后春笋般涌现，对病原基因 的认识也有了突飞猛进的进展随着对各个病原的全基因组序列了解广度的扩大，二代测序（NGS）已经能针对 任一给定菌株，测定具体的序列，这些不同的独立基因，就是病原个性化的标志。

反过来，根据对未知病原体的测序便能够推断并确定病原体同时，二代测序还能 够确定耐药基因，明确病原体的耐药特点，以及测定其他蛋白表达水平，为我们全 面立体认识患者感染的病原体提供支持目前已经广泛运用在MASA、结核等病原体 中图1： 1995-2010年针对基因组研究工程的数目临床棘手的结核，目前诊断方法上分为两大类:&零八食区学中《北克上45优> 质谱分析(MALDI-TOFMS)L特异性PCR检测，如LPA* 2全基因组测序发光二极管荧光显微镜检(㈤)LBactec MQT 960快速液体培养系统2 .TK 5LC-年核分枝杆菌快速培养系统.显微镜观察药物敏感性(MODS)LY-干扰素释放试验（mA）ZBetemioe TB-LAM Ag1 Xpert MTB/R1F or Xpert MTB/R1F Ultra2环介导等温扩增技术(gp)3 .宏基因组检测图2：结核诊断技术2014年新英格兰杂志上发表的一篇报告那么成了二代测序一 个划时代的标志让我们一起来看一看这个病例：一名14岁患有严重先天性免疫缺 陷病的儿童，主要病症为反复发热头痛，患病4个月后出现昏迷虽然医生考虑是神经系统感染，但利用了当时多达38项各种各样的检测方法， 均未明确病原体。

找不到病原，严重限制了医生的治疗选择幸而，利用对脑脊液CSF的二代测序，终于有了突破性发现，测序结果发现了 CSF中的钩端螺旋体序列在这个基础上，医生有方向的通过血清学检测和特异性 PCR检测，均证实了钩端螺旋体的感染最后，这名儿童在运用青霉素治疗后很快好转，治疗有效！在这个案例中，二 代测序为陷于诊断泥淖中的医生提供了一根绳索，帮助临床医生及时找到了病原 体，在发生更严重的不可逆转的神经系统损伤前挽救了这名可怜的孩子二代测序——不可不知的3件事1 .二代测序的特点与优点通量极大・ 非靶向测序不依赖于培养菌株・ 既可以发现病原体，又可以发现完全未知的病原体止匕外，二代测序的应用还有一些优点：・ 对病毒检测较为方便，尤其是HSVT、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病 毒等；提高疑难感染性疾病病原诊断能力；・ 高效诊断：对于需借助特殊的染色或免疫学检查等方法的病原体，原本诊断需要等待时间较长，二代测序能快速鉴别诊断；・ 既可以发现病原体，又可以发现完全未知的病原体；检测结果受抗生素影响很小；・ 与传统检测方法联用能有效提高病原检出效率；在局灶感染中直接检测感染部位的标本更有显著优势2 .二代测序检测价值有几何？mNGS和临床微生物检测（同次）在不同标本检测价值的比拟mNGS临床微生物检测（同次）100%90%80%70%60%50%40%30%20%10%0%图3：二代测序的检测价值对超过700例儿童进行测序，测序标本以CSF最多, 其他还有血、脓液等其他组织标本。

整体结果显示，二代测序检出阳性率，脓液标 本达100%,而临床上针对脓液的传统检测阳性率不到50%所有标本总和计算，临 床传统方法仅9.1%阳性检出率，二代测序那么能有效提高至26%o3 .结果影响因素有哪些?因素NGS阳性组 (n=41)NGS阴随 (n=58)P年龄（天）230(69.5-425)116.5(65.5-392.5)0.379留取标本距离起病时间（天）15(8.5-28)^31(17-45)0主诉时间（天）6(4-21)'25(4-41)0.005确诊时间（天）4(2-8)3(1-6.75)0.660外周mWBC (xlOA9/L)17.3 ±11.913.5±7.30.074NE (%)66.7 ±15.754.7 ±20.20.002Hb (g/L)104.0 ±19.9103.8 ±17.20.943CRP (mg/L)29 (11.0-101.1)27.7(8-108.5)0393首次CSFWBC (xlOA6/L)910(336-2825)403(98-2040)0.125多核（％）70(38.75-85)60(22-75)0.165单核（%）24.3(15-55.5)38.5(23.0-75.0)0.099Pro (mg/L)1278(837-2234)1340(596-1982)0.485Glu (mmol/L)147(0.87274)2.48(1.02-2.48)0.120NGS同次CSF WBC (xlOA6/L)10(2-17)11(2-37)0.432多核（%）10(4-16)12(5-20)0.723单核（%）20(12-28)30(15-54)0.051Pro (mg/L)557(296-1149)594(367-1079)0.850Glu (mmol/L)2.85(2.43-3.46)2.90(2.46-3.66)0.869Guo LY. et al JI^ct. 20IS Dec 12 pii S0163工5“1S）3 W4图4：二代测序的影响因素在众多可能影响因素中，对临床工作最具有指导意义 的，即尽可能缩短患者出现主诉后的时间，和留取标本距发病的时间，这样能最有 效的提高测序所能测得的序列数，增加检出可能。

简单来讲就是，早发现，早取 样，二代测序不用怕二代测序未来之路虽然二代测序在辅助进行病原诊断上具有很大的贡献，尤其是疑难、少见病原 体但是临床上仅仅二代测序的结果阳性，其他传统方法阴性的现象并不少见对 于这种情况，是继续坚持传统方法检测直至阳性用药，还是基于二代测序结果尝试 性用药？目前仍主要依赖于临床医生的个人判断所以，临床亟需一个统一的标准来评价二代测序的结果可信性目前采用二代 测序的结果尚需要慎重判断但是无论如何，基因诊断、精准医学的时代已经到 了手握一个未知菌株，便能很快通过二代测序确定具体菌株，掌握耐药特点和菌 株毒力，还能预测抗生素的敏感性一一这将是最好的时代！新的诊断技术已经来到 身边，为了防止滥用，刘钢教授提出将重视临床诊疗规范和重视新技术应用规范与 评价相结合，利用二代测序新技术助力病原精准诊断。