医学专题—乳铁蛋白.ppt

乳铁蛋白乳铁蛋白第一页，共二十八页 乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力(qiánlì)的食品和饲料添加剂 乳铁蛋白乳铁蛋白(Lactoferrin，Lf) 是一个大约有700个氨基酸残基构成的、分子量约为80KDa的单体糖蛋白，属于转铁蛋白家族，主要由乳腺上皮细胞表达和分泌 因其晶体呈红色(hóngsè)，故也有学者称之为“红蛋白”定义定义(dìngyì)第二页，共二十八页 乳铁蛋白广泛分布(fēnbù)于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中（包括泪液、精液、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞，人乳中乳铁蛋白浓度约为，是牛乳中的10倍（牛乳中含量为），占普通母乳总蛋白的20%分分 布布第三页，共二十八页血液中乳铁蛋 白主要(zhǔyào)来自中性白细胞，骨髓、子宫内膜及胎盘等也能分泌少量的乳铁蛋白进入血液 第四页，共二十八页第五页，共二十八页人在泌乳(mì rǔ)期间，乳铁蛋白含量随着泌乳(mì rǔ)时间的不同而发生变化，如人初乳中乳铁蛋白可达6-14mg/ml，常乳期降至1mg/ml。

第六页，共二十八页u乳铁蛋白由700个左右(zuǒyòu)的氨基酸组成人乳铁蛋白分子量为82.4KDa，有692个氨基酸残基；牛乳铁蛋白分子量为83.1KDa，由689个氨基酸组成u乳铁蛋 白 N 端 (1 ～338) 与 C 端 (339 ～692) 两个(liǎnɡ ɡè)球状结构相应位置上有 37％ (125 个) 的氨基酸完全相同结构结构(jiégòu)及性及性质质u人乳铁蛋白与牛乳铁蛋白结构相似，氨基酸残基组成单链，两端折叠成球形(N叶和 C 叶)，中间由一段螺旋肽链连接呈现“二枚银杏叶型”结构第七页，共二十八页u在晶体结构中Phe17～Leu29间肽链形成α-螺旋结构，Ser33～Arg39间无规则卷 曲结构并使一个平行 β -折叠结构与N 端相连Phe17 ～Leu29间肽段具有较强 的抗菌活性，如果将其a -螺旋变成β-折叠结构抗菌活性有较大提高(tí gāo)，可能是由于 β-折叠结构易于细菌表面接触的缘故u每个分子中有2个金属结合(jiéhé)位点，每个位点可结合(jiéhé)一个Fe3+ 和 一 个HCO3- 或 CO32-第八页，共二十八页u乳铁蛋白对胰蛋白酶类具有很强的抗降解能力，尤其是结合铁离子后抗降解能力增强，因此在肠道内不易被降解，能以完整(wánzhěng)分子的形式被吸收。

这种抗蛋白酶水解的特性可能与糖基化有关 u在铁离子(lízǐ)结合结构域中包括三个阴离子(lízǐ)配子体(两个酪氨酸残基，一个天冬氨酸残基)和一个组氨酸残基，可与铁离子形成稳定的结合u在酸性(suān xìnɡ)条件下对热稳定; 在碱性条件下,高于80℃即开始凝胶化第九页，共二十八页u 根据Lf结合Fe的多寡，可将其分为缺铁型乳铁蛋白(apoLf)、铁半饱和型乳铁蛋白和 铁饱和型乳铁蛋白(Holoix)三种形式不同形式的Lf具有(jùyǒu)不同的抗变性能力，其抗巴 氏杀菌热变性能力依次为：Holoix > 铁半饱和型乳铁蛋白 >apoLf u 牛乳(niú rǔ)Lf的等电点pH值为8.2左右，人Lf的等电点为6左右第十页，共二十八页1、乳、乳 铁铁 蛋蛋 白具白具 有有 广广 谱谱 抗抗 菌菌 作作 用用Lf抑菌效果取决于微生物对铁的需求程度、外源铁的生物利用率、Lf的铁饱和度 、 盐类、pH值、抗体(kàngtǐ)或其他免疫物质、介质等生物学功能生物学功能(gōngnéng)第十一页，共二十八页u首 先 ， Lf 对 革 兰 氏 阴 性 菌 和 阳 性 菌 的 抑 菌 作 用 是 由于(yóuyú) 乳 铁 蛋 白 高 度 结 合 铁 ， 使 细 菌 失 去 生 长 所 需 的 基本 元 素 铁 ；u 其 次 ， L f 通 过 氨 基 末 端 强 阳 离 子 结 合 区域 ，增 加 细 菌 细 胞 膜 的 通 透 性 ， 使 细 菌 的 脂 多 糖 从外 膜 渗 出 ，达 到 直 接 杀 菌 作 用； u另 外 ， Lf 可 通 过水 解 得 到 的 抗 菌 肽 来 实 现 抗 菌 作 用。

将 Lf 通 过蛋 白 酶 水 解 获 得 一 些 低 分 子 量 的 肽 ， 这 些 肽 的 抗 菌活 性 大 幅 度 增 强 ， 可 抑 制 G+ 和 G- 菌 生 长 ， 其 中 包括 一 些 对 Lf 具 有 抵 抗 性 的 菌 株 目 前 认 为 Lf 的 抗 菌 机 理 可 能 有 以 下 3 个 方 面 ：第十二页，共二十八页2、乳、乳 铁铁 蛋蛋 白白 具具 有有 抗抗 病病 毒毒 作作 用用天 然 的 Lf 能 够 抑 制 人 免 疫 缺 陷 病 毒 和 巨 细 胞 病 毒 对 M T4 细 胞 和 成 纤 维 细 胞 的 病 变 作 用 ， 此 外 ， 还 具 有 抑 制 流 感 病 毒 的 活 性 ， 主 要 是 因 为 其 碳 水 化 合 物 残 基 上 含 唾 液 酸 ， 它 干 扰 病 毒 对 靶 细 胞 的 结 合 和 侵 染 乳 铁 蛋 白 通 过 抑 制 病 毒 进 入 细 胞 ， 减 轻 对 人 体 肝 细 胞 的 损 害第十三页，共二十八页3、乳、乳 铁铁 蛋蛋 白白 具具 有有 抗抗 氧氧 化化 作作 用用 研 究 结 果 显 示 ， 乳 铁 蛋 白 能 抑 制 铁 诱 导 的 脂 质 过 氧 化 过 程 所 产 生 的 硫 代 巴 比 妥 酸 和 丙 二 醛 的 生成(shēnɡ chénɡ) 。

另 外 ， 牛 乳 铁 蛋 白 能 降 解 酵 母 中 的 tR N A ，具 有 核 糖 核 酸 酶 的 活 性 ， 且 能 抑 制 超 氧 离 子 的 形 成 所有 这 些 都 可 降 低 人 体 内 自 由 基 对 动 脉 血 管 壁 弹 性 蛋 白 的 破 坏 ， 达 到 预 防 和 治 疗 动 脉 粥 样 硬 化 和 冠 心 病 的 目 的第十四页，共二十八页4、乳、乳 铁铁 蛋蛋 白具白具 有有 抗抗 癌癌 作作 用用 乳 铁 蛋 白 对 消 化 道 肿 瘤 ， 如 结 肠 癌 、 胃 癌 、 肝 癌 、 胰 腺 癌 ， 具 有 化 学 预 防 作 用 ， 并 可 抑 制 由 此 引 发 的 肿 瘤 转 移 另 外 ， 乳 铁 蛋 白 在 启 动 宿 主 防 御 系 统 的 初 始 活 化 反 应 ， 调 控 不 同 类 型 淋 巴 细 胞 比 例 的 改 变 对 机 体 免 疫 反 应 的 影 响 ， 提 高 免 疫 力 等 方 面 都 起 到 了 促 进 作 用 第十五页，共二十八页5、乳、乳 铁铁 蛋蛋 白白 调调 节节 机机 体体 免免 疫疫 反反 应应 乳 铁 蛋 白 具 有 调 节 巨 噬 细 胞 活 性 和 刺 激 淋 巴 细 胞 合 成 的 能 力 ； 而 且 嗜 中 性 粒 细 胞 是 含 乳 铁 蛋 白 最 多 的 细 胞 ， 在 机 体 受 感 染 时 可 以 将 乳 铁 蛋 白 释 放 出 来 ， 释 放 出 的 乳 铁 蛋 白 夺 取 致 病 菌 的 铁 离 子 致 使 后 者 死 亡 。

另 外 ， 经 研 究 显 示 ， 乳 铁 蛋 白 对 抗 体 生 成 、T 细 胞 成 熟 、 淋 巴 细 胞 中 自 然 杀 伤 细 胞 比 例 都 具 有 调 节 作 用第十六页，共二十八页6、乳、乳 铁铁 蛋蛋 白白 调调 节节 胃胃 肠肠 道道 铁铁 的的 吸吸 收收 乳 铁 蛋 白 通 过 它 的 氨 基 和 羧 基 末 端 两 个 铁 结 合 区 域 能 高 亲 和 性 地 ， 可 逆 地 与 铁 结 合 ， 并 维 持 铁 元 素 在 一 个 较 广 的 p H 值 范 围 内 完 成 铁 在 十 二 指 肠 细 胞 的 吸 收 和 利 用 第十七页，共二十八页7、乳、乳 铁铁 蛋蛋 白白 同同 药药 物物 的的 协协 同同 作作 用用 研 究 显 示 ， 乳 铁 蛋 白 能 同 多 种 抗 生 素 和 抗 病 毒 药 物 协 同 作 用 ， 减 少 药 物 用 量 ， 降 低 抗 生 素 或 抗 真 菌 制 剂 对 人 肝 肾 功 能 的 损 害 同 时 ， 增 强 体 内 微 生 物 对 药 物 的 敏 感 性 第十八页，共二十八页第十九页，共二十八页。

影影 响响 Lf Lf 功功 能能 的的 因因 素素u实验证明，婴儿或仔畜出生初期，Lf降解程度很低，随后迅速升高，生理功能也逐渐消失uLf的抑菌作用具有很强的铁依赖性，只有在其处于不饱和状态时，才具有较强的抑菌能力，而在Lf呈铁饱和状态时，抑菌作用也不复存在upH值也影响Lf的活性，在pH中性环境中，Lf活力(huólì)较强，当pH < 6 时，则基本无抑菌功能u盐的种类明显影响Lf的抑菌能力，碳酸盐可增强Lf的抑菌作用，而柠檬酸盐则会减弱 Lf的抑菌作用， 肠液内存在 HC03一， 因此有利于Lf发挥抑菌功能u此外， 抗体或其他免疫物质也会影响Lf的抑菌能力，例如，Lf和初乳中的IgA 、 IgG就具有协同抑菌的作用Lf只有在维持其活性不被降解的前提下，才能(cáinéng)发挥生理功能第二十页，共二十八页乳铁蛋白的生产乳铁蛋白的生产(shēngchǎn)制备方法制备方法牛初乳富含LF,可采用(cǎiyòng)色谱法、超滤法、盐析法、酸沉淀法等方法从初乳中提取乳铁蛋白 牛初乳经冷冻离心机脱脂 ,35℃下加入适当稀释的皱胃酶液 ,分离去除酪蛋白. 微滤后即为用于超滤研究的物料. 用 MWCO为100000的超滤膜进行首次超滤 ,透过液再用MWCO为50000的超滤膜进行第二次超滤 ,然后用 MWCO为10000的超滤膜进行浓缩(nónɡ suō) ,冷冻干燥 ,即得到Lf 的粗品.超滤法超滤法：第二十一页，共二十八页。

LfLf的分离纯化的分离纯化(chún huà)(chún huà)及检测方法及检测方法 目 前 鉴 定 乳 铁 蛋 白 的 方 法主 要 有 ： 免 疫 双 扩 散 法 、酶 联 免 疫 检 测 法 (E L ISA ),反相高效(ɡāo xiào)液相色谱法等第二十二页，共二十八页反相高效反相高效(ɡāo xiào)(ɡāo xiào)液相色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白含量液相色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白含量色谱条件色谱柱：Kromasil C4色谱柱（250mm*4.6mm,5μm）流动(liúdòng)相：乙腈-水-三氟乙酸（80:20:0.1)流速0.6mL/min;检测波长:220nm,柱温：25℃；进样量10.0μL样品溶液的制备量取新鲜牛初乳离心除脂肪，得到的脱脂乳调pH值至4.6，离心除酪蛋白，收集(shōují)乳清，然后调pH值至6.8，加硫酸铵使饱和度达到40%，离心取乳清液，用截留分子量为300Ku、100Ku、30Ku的超滤膜包进行超滤，收集30Ku膜包超滤后的回留液进行离子交换层析，收集洗脱峰，即为样品溶液第二十三页，共二十八页精密称取乳铁蛋白标准品1mg,配制浓度分别(fēnbié)为1、0.5、0.25、0.125、0.05、0.025mg/mL的对照品溶液。

乳铁蛋白进样量浓度(nóngdù)在25-1000g/mL时，线性关系良好第二十四页，共二十八页 取样品进行RP-HPLC检测如图3所示为离子交换层析(cénɡ xī)后收集各洗脱峰，其中峰1、2为未吸附蛋白流穿液，峰3为低盐浓度洗脱液，峰4为高盐浓度洗脱液，即提取的乳铁蛋白洗脱液 图4为峰4洗脱液经RP-HPLC检测结果结果显示牛初乳经除脂肪、除酪蛋白、超滤和离子交换层析后，提取的乳铁蛋白的平均纯度为92.23%，RSD为1.3%第二十五页，共二十八页u作为一种高效补铁组分，Lf可用作食品添加剂，以改变婴幼儿及孕妇普遍缺铁的现状 ， 也可制成含铁饮料或补铁胶囊，用来提高造血功能，改善贫血u在食品或乳制品(如婴幼儿奶粉)甚至口香糖中，添加Lf可调节免疫功能u国外在乳制品中补充益生菌和Lf，制成片剂或速溶饮料，作为运动员的营养品u把Lf添加到碳酸饮料、焙烤食品中既具营养价值，又可增进(zēngjìn)消化功能u在肉食生产中，可利用 Lf抑制产品表面因人手接触等原因而滋生的有害细菌u在玉米油乳化体系及卵磷脂脂质体系中Lf具有抗氧化功能实验证明， Lf可改进大豆油粉末的保质期。

u总之，Lf因其具有多种生理活性功能，在乳品、食品、生化、医药、化妆品等领域已得到广泛应用，其开发前景不可限量乳铁蛋白的应用乳铁蛋白的应用(yìngyòng)第二十六页，共二十八页感谢您的关注感谢您的关注(guānzhù)(guānzhù)！！第二十七页，共二十八页内容(nèiróng)总结乳铁蛋白乳铁蛋白(Lactoferrin，Lf) 是一个(yī ɡè)大约有700个氨基酸残基构成的、分子量约为80KDa的单体糖蛋白，属于转铁蛋白家族，主要由乳腺上皮细胞表达和分泌另 外 ， 牛 乳 铁 蛋 白 能 降 解 酵 母 中 的 tR N A ，具 有 核 糖 核 酸 酶 的 活 性 ， 且 能 抑 制 超 氧 离 子 的 形 成第二十八页，共二十八页。