姜黄素抗肝纤维化分子机制研究进展.doc

1姜黄素抗肝纤维化分子机制研究进展作者：徐波 陆茵 吴家明 张丽娟【关键词】 姜黄素 肝纤维化 综述肝纤维化(Hepatic Fibrosis,HF)是继发于各种形式慢性肝损伤之后组织修复过程中的代偿反应,这些损伤包括病毒感染、药物造成的肝炎以及长期酗酒等,它也是慢性肝病发展为肝硬化必经的病理过程如果早期没有得到有效治疗,HF 就会发展为肝硬化HF 实质是肝内细胞外基质(ECM)合成大于降解导致大量 ECM 过度沉积随着对 HF 发生机制的深入研究发现,HF 在进入肝硬化前尚可逆转,是一种可逆性的病变,及时地干预 HF 的病程能够减少 HF 及其致命并发症的产生近年来关于中药防治 HF 的研究报道颇多,其中姜黄素预防及干预 HF 的研究成为国内外的研究热点并在其分子机制研究方面取得了较大的进展笔者现就近些年来对姜黄素再预防和治疗 HF 药理作用和分子机制的最新进展加以归纳综述1 姜黄素概述姜黄为姜科姜黄属植物(Curcuma L.)的干燥根茎,具有破血行气、通经止痛的功效,主要用于治疗胸胁刺痛、闭经、风湿肩臂疼痛、跌打肿痛姜黄素(Curcumin)为姜黄的主要活性成分之一,是从姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然有效成分,其理化性质为可溶于甲醇、乙醇、碱、醋酸、丙酮和氯仿等有机溶剂,在水中溶解度低,多数水溶液中的实验是在小于 50 μmol/L 的浓度进行,姜黄素对热稳定,但在光照和碱液中不稳定,在贮存和运输过程中要注意避光,避免与碱性物质接触。

姜黄素已被广泛用作色素、食品添加剂及调味品大量研究证明,姜黄素具有抗氧2化、抗肿瘤、抗炎、清除自由基、抗微生物以及对心血管系统、消化系统等多方面药理作用2 姜黄素可通过不同途径预防和治疗肝纤维化2.1 影响肝星状细胞活化、增殖及凋亡肝星状细胞(HSC)增生和激活是 HF 发生的中心环节,激活后的 HSC 进一步转化为成肌纤维细胞,后者可大量合成 ECM 蛋白,而 ECM 的大量沉积最终导致了HF 的形成,可见,肝星状细胞在 HF 中起到了十分重要的作用HSC 的激活过程分为两个阶段：启动阶段和持续阶段启动阶段是指肝脏炎症坏死时,受损的肝细胞和邻近的内皮细胞、Kuffer 细胞(KC)以及淋巴细胞、血小板等释放可溶性因子,继而激活 HSCHSC 在 KC、转化生长因子 β1(TGF-β1)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)、肿瘤坏死因子 α(TNF-α)、白细胞介素(IL-1、IL-6)等作用下,HSC 激活、增殖、表型变化,开始表达肌源性特异性指标结合蛋白(Desmin)和 α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),最终转变成肌纤维细胞[1-2]启动阶段是基因表达及表型的早期变化,在这一阶段,HSC 对细胞因子和刺激产生应答,包括转录激活、信号分子激活和早期结构基因的诱导等。

持续激活阶段是指由于这些刺激作用而维持 HSC 激活状态并有纤维化的形成,激活的 HSC 在多种促有丝分裂因子作用下分裂增殖的同时,自身也分泌多种细胞因子,主要有 TGF-β1、PDGF、成纤维细胞生长因子(bFGF)、HGF,进一步促进 HSC 的激活,并使已被激活的 HSC 快速转化成为肌成纤维细胞[2-3],激活的 HSC 不断增殖,游走到损伤区域,产生收缩性,生成大量 ECM 蛋白,最终导致 HF 的发生3活化的 HSC 在 HF 的过程中主要起到以下几方面作用：①合成和分泌 ECM活化的 HSC 可分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、透明质酸等多种 ECM 成分②参与炎症趋化作用③产生基质金属蛋白酶(MMPs)及基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs),调节 ECM 的积聚和降解,在 HF 过程中,MMPs 的含量及活性并不降低,而是由于 TIMPs 的抑制使 MMPs 不能发挥降解基质的作用,导致 ECM 过度沉积④调节肝窦微循环姜黄素通过诱导 HSC 凋亡,抑制 HSC 活化和增殖,减少 ECM 合成的来源,促进细胞外基质的降解,有利于 HF 恢复2.1.1 诱导肝星状细胞凋亡 赵氏等[4]通过流式细胞仪、电镜形态学观察和 DNA 片段化检测的方法,证实了姜黄素可以诱导 HSC 发生凋亡,表现为亚 G1 峰的出现、凋亡小体和 DNA 梯度带形成等细胞凋亡的典型表现；进行细胞周期分析还发现,姜黄素可使 S 期细胞减少,G2/M 期细胞增多,说明姜黄素可通过抑制细胞周期蛋白的磷酸化,调控 G2/M期位点,使细胞周期进程减缓,细胞停滞于 G2/M 期,进而诱导细胞凋亡。

Xu 等[5]也发现,姜黄素可以抑制 HSC 的增殖并发生凋亡舒氏等[6]通过流式细胞仪、投射电镜、琼脂糖凝胶电泳法检测不同浓度姜黄素处理后的 HSC-T6 凋亡,流式细胞术检测到明显的亚 G1 峰,各组凋亡指数与对照组比有明显差异,透射电镜观察到细胞皱缩、核染色质浓缩沿核膜排列和凋亡小体形成等,琼脂糖凝胶电泳可见到明显的 DNA 梯带形成,得出姜黄素可以诱导 HSC 凋亡,其作用具有时间和剂量依赖性4何氏等[7]通过体内实验,观察姜黄素预防大鼠 HF 作用及对活化 HSC 的数目、凋亡等的影响,探讨两者的关系用 CCl4 造模同时给与姜黄素,设立正常对照组、HF 组和阳性对照组,发现姜黄素可明显改善 CCl4 所致大鼠 HF 的病理学改变,α-SMA 在 HF 时明显增多,姜黄素使活化 HSC 数量减少、HSC 凋亡增加,且具有量效关系2.1.2 抑制肝星状细胞增殖杨氏等[8]以 HSC 为靶细胞探讨姜黄素对 HSC 增殖及分泌细胞外基质的影响,用不同浓度的姜黄素处理大鼠 HSC,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色分析法测定细胞的增殖,结果表明,在 1～20 μmol/L 浓度范围内,姜黄素对 HSC 无细胞毒性作用,却剂量依赖地抑制 HSC 的增殖。

平氏等[9]也发现姜黄素在 10～50 μmol/L 范围内呈剂量依赖性地抑制体外培养大鼠传代 HSC 的增殖谢氏等[10]发现其对肝细胞株 HSC-T6 的增殖有抑制作用,且呈时效和量效关系,10 μmol/L 的效果最佳2.1.3 抑制肝星状细胞活化Kang HC 等[11]通过体内和体外实验发现,姜黄素可以抑制 HSC 由静止表型向活化表型的转化,使其活化标志物 α-SMA 表达减少,Ⅰ型胶原合成降低,降低Ⅰ型胶原 mRNA 表达量体内实验动物给予姜黄素后,其肝脏胶原沉积及 α-SMA 阳性区域减少,Ⅰ型胶原水平降低体外实验中将姜黄素(5 mg/mL)作用于体外培养的HSC 能够减少 DNA 合成,下调 α-SMA、Ⅰ型胶原及Ⅰ型胶原 mRNA 的表达 Bruck R 等[12]用硫代乙酰胺大鼠造模并同时给与姜黄素,对照组仅给硫代乙酰胺,12 周后姜黄素组大鼠肝脏组织病理特征、羟基脯氨酸水平、脾重均低于对照组,免疫组化和原位杂交法证明了姜黄素能够抑制肝星状细胞活化以及Ⅰ型胶原的基因5表达,通过硝基酪胺酸染色发现姜黄素能够缓解氧化应激,但是姜黄素仅能预防HF 而并不能够逆转已经形成的 HF,他们还通过体外实验证明姜黄素可以显著抑制 TNF-α 的表达。

杨氏等[8]也发现,姜黄素可抑制 HSC 分泌Ⅰ型胶原、透明质酸、层粘连蛋白等 ECM 的成分2.1.4 作用机制 PPAR-γ 的激活是姜黄素抑制 HSC 活化、抑制 HSC 增殖、诱导凋亡和抑制 ECM 表达等诸多作用最基本的分子机制过氧化物酶体增殖因子活化受体(Peroxisome proliferator- actived receptor,PPARs)在 HSC 早期活化中起到了重要的作用它有 3 种形式：PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γPPAR-γ 是类固醇/甲状腺激素类核受体超家族的成员,广泛表达于肠道、胰腺和肝脏,并通过抑制炎症性细胞因子的转录而产生抗炎作用体内实验发现,PPAR-γ 表达于正常鼠肝脏的 HSC,但在纤维化肝的 HSC 上表达明显下调体外实验也发现,PPAR-γ 在培养的 HSC 活化后表达下调,PPAR-γ 配体能抑制 HSC 增殖、α-SMA、Ⅰ型胶原的表达,说明 PPAR-γ 在维持静止 HSC 表型上起重要作用[13]内源性 PPAR-γ 在静息型 HSC 中高水平表达而且具有功能活性,但是在体外与体内活化的 HSC 中表达水平明显下降特异性 PPAR-γ 激动剂可以抑制 HSC 活化,表达 PPAR-γ 的腺病毒能够逆转活化 HSC 的表型,使其恢复为静息状态。

有报道表明,通过促效剂激活 PPAR-γ,可明显抑制体外体内活性 HSC 的 I 型胶原基因表达[14]Xu 等[5]研究发现,姜黄素能够通过诱导 PPAR-γ 基因表达并激活 PPAR-γ 的活性而抑制活化的 HSC 增殖,用 PPAR-γ 的对抗剂阻断姜黄素的转录活性,能够显著削弱姜黄素对 HSC 增殖的抑制效应平氏等[9]也探讨了姜黄素抑制 HSC 活化作用与 PPAR-γ 信号转导途径之间的关系,发现 PPAR-γ 特异性阻断剂 GW9662 可以6阻断姜黄素对 HSC 活化及增殖的抑制作用,说明姜黄素可能是通过激活 PPAR-γ信号转导途径来抑制 HSC 的活化和增殖成氏等[15]通过实验发现,姜黄素在10～50 μmol/L 范围内呈剂量依赖性抑制 HSC 的增殖姜黄素对增殖的抑制作用可以被 PPAR-γ 特异性拮抗剂 GW9662 所阻断,在原代培养和传代培养的 HSC 中,PPAR-γ 基因表达水平随着 HSC 活化程度的增加而不断下降姜黄素显著上调PPAR-γ 表达水平,这种作用能够被 GW9662 阻断,姜黄素能够在基因和翻译水平显著抑制 α-SMA 证实了姜黄素可以通过上调 PPAR-γ 抑制 HSC 的活化和增殖。

Shizhong Zhen 等[16]通过一系列体外实验,阐明了 PPAR-γ 的激活在姜黄素诱导活化型 HSC 细胞凋亡和抑制 ECM 基因表达过程中的作用,认为姜黄素诱导活化HSC 中 PPAR-γ 的基因表达并诱导 PPAR-γ 激活,这是其抑制 HSC 生长的分子机制PPAR-γ 的激活介导姜黄素抑制活性 HSC 中 cyclin D1 表达而 cyclin D1 表达的抑制又促进 PPAR-γ 表达和激活另外,姜黄素通过 PPAR-γ 激活来抑制 ECM基因的表达,包括那些编码Ⅰ型胶原和纤维结合蛋白的基因这一抑制效应可能是通过阻断 TGF-β 信号途径达成的,包括抑制 TGF-β 受体的表达,但是姜黄素对活性 HSC 中潜伏性 TGF-β1 的释放和激活没有影响TGF-β 介导的信号通路在 HSC 激活以及 ECM 的产生中也占据着重要地位,TGF-β 是促进 HSC 中 ECM 生成的最为重要的纤维生成因子,哺乳动物 TGF-β 有3 种：TGF-β1、2 和 3,在静止状态下 HSC 表达 TGF-β 极少,肝损伤后其 3 种 TGF-β表达均明显增加,HSC 是 TGF-β 的主要细胞来源。

TGF-β 前体激活并激活其受体,受体磷酸化并结合细胞浆 Smad 蛋白,Smad 复合物移动到细胞核并成为转录调节因子,这是一条总的 TGF-βSmad 信号传导通路但 HSC 在活化状态不同,其内信号转导的具体过程却有差别Furukawa 等[17]研7究发现,对于静止的 HSC,TGF-β 信号可磷酸化其内 Smad3 的 C 末端及联接区域；而对于活化的 HSC,Smad3 联接区域由 p38 MAPK 介导磷酸化,继而引起 Smad3与 Smad4 的联接并结合于 HSC 核内纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor, PAI-1)转录启动子上当由 TGF-βⅠ型受体(TGF-β typeⅠ receptor,TβRⅠ)通路磷酸化 Smad2 后,后者转移至核内并与 Smad3、4 形成的复合物结合,。