实验六：薄层层析与柱层析.doc

大学化学实验1实验六 薄层层析与柱层析实验目的1. 了解偶氮苯的光学异构反应，加深对光化学反应的理解2. 掌握薄层层析的基本操作,薄层层析分离顺、反式偶氮苯3. 了解柱层析分离有机化合物的原理，初步掌握层析柱装填和洗脱的操作方法4. 采用柱层析分离反式偶氮苯与靛红的混合物实验原理 Nhv激 发 态 N+N顺 式 反 式偶氮苯是最简单的芳香偶氮化合物，众多偶氮染料的母体结构含有两个苯基分别与偶氮基–N=N–两端相连的结构偶氮苯有毒，易燃偶氮苯有顺（Z）-反（E）-异构体反式为橙红色棱形晶体，蒸气为深红色，溶于乙醇、乙醚、醋酸和水反式的热力学性质稳定当溶于乙醇的偶氮苯用一定强度的紫外光照射时，顺式的比例逐渐增大，直至达到平衡，形成顺反异构体的混合物偶氮苯的光致异构是很多偶氮类功能材料光响应的基础顺式为橙红色片状晶体，不稳定，在加热或可见光照射下能够变成反式色谱方法是通过在固定相和流动相间分配的不同而将物质分离开待分离混合物各组分在固定相上的吸附强度不同，与流动相一起移动的速度也不同，因此被分离开薄层色谱属于固-液吸附色谱薄层色谱板中的固定相中的微孔结构使得溶剂在毛细管作用下能够沿着色谱板向上移动。

由于混合物中各组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，当展开剂（流动相）流经吸附剂时发生无数次吸大学化学实验2附解附过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动，吸 附 力 强 的 组 分 滞 留 在 后 ，由 于 各 组 分 具 有 不 同 的 移 动 速 度 ， 最 终 在 固 定 相 薄 层 析 上 分 离 TLC 除 了 用 于 分 离外 ， 还 可 以 通 过 与 已 知 结 构 的 的 化 合 物 比 对 ， 鉴 定 少 量 有 机 混 合 物 的 组 成 ，它 也 是柱 色 谱 寻 求 最 佳 展 开 剂 的 手 段 上 图 中 红 色 化 合 物 的 Rf 等 于 竖 直 红 线 的 长 度 除 以 竖直 蓝 线 的 长 度 NHOIsatin柱 层 析 也 属 于 固-液吸附色谱在一根玻璃“分离柱”中进行管中装上适当的粉末作为国定相待分离或纯化物质的溶液（流动相）在重力作用下流经吸附剂时，不同物质对溶剂和吸附剂的亲和力不同，因而被吸附的程度不同，从而以不同速度流动，使化合物得以分离靛红与偶氮苯在极性上具有较大差异，从而可以使用极性适中的展开剂，通过柱层析将二者分离仪器与试剂分析天平，TLC，锥形瓶，毛细管，层析柱，棉花，量筒，硅胶，蒸发皿，展缸；EtOAc, CH 2Cl2, 石油醚，靛红；请自带尺子（用于计算 Rf值）颜老师在实验开始之前已经准备好的试剂：a. 偶氮苯的溶液（ 15 mg in 1mL EtOH） ；b.靛红的溶液（15 mg in 1mL CH2Cl2） ；c. 靛红与偶氮苯的均匀混合物（靛红 1.4 g + 偶氮苯 3.5 g） 。

实验内容a) 光照异构化取 0.1 g 反式偶氮苯溶于 5 mL 无水乙醇中，将此溶液放于试管中，密封，置于可见光下二星期，以便与光照前的溶液进行对比b) 薄层层析取管口平整的毛细管吸取光照后的偶氮苯溶液，在离薄层板边沿约 0.5 cm的起点线上点样再用另一毛细管吸取未经光照的反式偶氮苯溶液点样待乙醇挥发后，将点好样品的薄层板放入内衬滤纸的展缸中展缸内已放置展开剂（乙酸乙酯/石油醚=1/40）薄层板的点样端在下方，浸入展开剂，展开剂不大学化学实验3要没过起点线，也不要碰到样品点待展开剂前沿上升到离板的上端约 1 cm 处时，取出薄层板，立即用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，置于空气中晾干可观察到薄层板上经光照后的偶氮苯溶液点样处上端有两个黄色斑点（哪一个斑点是顺式的？哪一个斑点是反式的？）计算异构体的 值fR用上述相同的方法，采用 Ethyl Acetate : Petroleum Ether = 1:1 为展开剂，对靛红与偶氮苯的混合物进行 TLC，为下面的柱层析选择展开剂c) 柱层析1． 将层析柱固定在铁架台上，一定要保持柱子竖直2． 将层析柱洗净后在柱底部放入一小团脱脂棉花3． 在锥形瓶中称重 7g 硅胶（SiO 2） ，并用 Ethyl Acetate : Petroleum Ether (1:40)调匀。

在层析柱的下方放置一个锥形瓶，以收集流下的液体加入少量洗脱剂于层析柱中，以润湿棉花，使其贴在柱子下端4． 打开层析柱活塞，控制溶剂下流，将硅胶悬浊液沿柱子侧壁加入，并用少量的溶剂洗去残余的硅胶，并加入柱中用装有橡皮管或塞子由下向上轻轻敲击柱子外壁，将气泡赶出，使硅胶填装均匀并加压使硅胶紧密，以获得较好的分离效果轻轻敲击，使硅胶最上层成均匀平面，然后用药匙沿柱子侧壁，轻轻地、慢慢地在硅胶表面覆盖一层海砂（注意：不要破坏硅胶的上平面） 关闭活塞，备用5． 打开活塞，当溶剂液面降至海砂表面时，关闭活塞用滴管沿柱子侧壁加入靛红与偶氮苯混合物的溶液（称取 40 mg，置于 1.5mL 的塑料样品管，加入 1 mL 二氯甲烷（ CH2Cl2） ，超声振荡使其溶解） 打开活塞，使溶剂液面降至海砂表面，关闭活塞再用少量的展开剂洗塑料样品管，加入层析谱中，并注意洗去粘附在柱壁上的液滴，打开活塞，流到液面，关闭活塞重复上述操作，直到将所有化合物冲到硅胶里面6． 沿侧壁加入大量的洗脱剂 Ethyl Acetate : Petroleum Ether (1:40)，打开活塞，加压保持一定的流速，观察色带的形成和分离。

7． 当第一个有色带到达柱底时，并且没有流出之前，关闭活塞，倒空锥形瓶，打开活塞，收集全部色带然后，改用 Ethyl Acetate : Petroleum Ether (1:1)作为洗脱剂关闭活塞，换一个空的且干净的锥形瓶，打开大学化学实验4活塞当第二个有色带到达柱底时，并且没有流出之前，关闭活塞，倒空锥形瓶，打开活塞，收集全部色带柱层析分离结束8． 柱层析分离结束后，采用 TLC 对上述分离的两个溶液进行分析，总结分离效果同时，打开层析柱活塞，在加压下让展开剂流干，然后将硅胶倒入指定的固体废物桶中切勿倒入水槽或普通垃圾桶预习时的问题1.在薄层层析实验中，为什么点样的样品斑点不可浸入展开剂的溶液中？为什么进行薄层层析时展缸要盖上盖？2.当用混合物进行薄层层析时，如何判断各组分的在薄层板上的位置？靛红与偶氮苯，哪一个的极性较强？为什么？3.柱层析时柱中若留有空气或者是填装不均匀，对分离效果有何影响？如何避免？4.偶氮苯和靛红物理化学性质？毒性？有什么应用？偶氮苯光照异构化的机理？why is trans-azobenzene more stable than cis-azobenzene?其它阅读材料1.光化学由光的作用引起的化学反应近年来日益受到人们的重视，光合作用就是最重要的光化学反应。

研究激发态分子化学行为的光化学反应已经成为有机化学的一个重要分支光不仅可以引起多种多样的化学反应，合成各种前所未有的奇妙反应分子，而且与我们的日常生活及生命现象有着密切的联系2. 薄 层 色 谱1. 固 定 相 的 选 择氧化铝和硅胶是薄层层析色谱常用的固定相氧化铝多用于分离碱性或中性有机物；而硅胶的吸附性源于表面的 Si-OH 基，主要用于分离酸性、中性有机物质薄层色谱用的硅胶有薄层色谱用的硅胶有 60G、6OGF254、60H、60HF254和 60HF254+366 等类型，其中 G 表示含有 13％硫酸钙（作为黏合剂） ；H 表示不含硫酸钙；F254 表示含有 2％无机荧光物质，在 254 nm 的紫外光照射下发出绿大学化学实验5色荧光与硅胶相似，氧化铝也因含有黏合剂或荧光剂而分为氧化铝 H、氧化铝 G、氧化铝 HF254 和氧化铝 GF254 等类型黏合剂除硫酸钙外，还可用淀粉、羧甲基纤维素（CMC)2. 操作方法①点样在薄层板一端约 1cm 处，用铅笔轻轻划一条作为起点线样品用易挥发性溶剂溶解后，用毛细管吸取样品溶液，轻轻接触到起点线的某一位置上如果溶液太稀，可多点几次，但要等第一次样品溶剂挥发后，再点第二次。

点好样品后，待溶剂挥发干净，才可以进行下面的展开过程②展开剂的选择选择展开剂，首先应考虑对被分离物有一定的溶解度和解吸能力由于硅胶和氧化铝都是极性吸附剂，所以展开剂的极性越大，试样在薄板上移动的距离越远， 值（ 值是一个化合物在薄层板上上升的高度与展开剂上升的高度fRf的比值）越大例如，在分离过程中常发现 太小，说明展开剂极性不够，需fR要考虑加入一种极性强的展开剂进行调控发现 值太小，说明展开剂极性不f够，需要考虑加入一种极性强的展开剂进行调控常用展开剂的洗脱力由小到大的顺序为：石油醚、环己烷、四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙醋、丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇、水、冰乙酸、吡啶、有机酸等此外，在展开过程中，展开缸内展开剂的蒸气须始终处于饱和状态一般可用一块方型滤纸贴于缸壁上（下端浸于展开剂中） ，盖好密封一段时间取放薄层板应迅速大学化学实验6③显色展开后，要等溶剂挥发完才能显色若被分离的是有色组分，展开板上即呈现出有色斑点若化合物本身无色，则可以在紫外灯观察有无荧光斑点；或用碘蒸气熏的方法显色显色后，用铅笔轻轻画出斑点位置，计算 值fR3．柱色谱吸附层析柱的分离效果不仅依赖于吸附剂和洗脱溶剂的选择，而且与制成的层析柱有关；要求柱中的吸附剂用量为被分离样品量的 30-40 倍，若需要可增至 100 倍。

柱高与直径之比为 4:1 至 10:1，一般为 7.5:1实验室常用的层析柱,其直径在 0.5-10 cm 之间当吸附物的色带占吸附剂高度的 1/10—1/4 时，此层析柱已经可作层析分离了柱层析常用吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙及活性炭等，吸附剂要求颗粒大小均匀，越细分离效果越佳，但此时洗脱阻力会增大，所以要选择合适大小的吸附剂氧化铝分酸性、中性和碱性三种，本实验应用中性氧化铝化合物的吸附能力与它的极性成正比，具有较大极性基团的化合物，其在吸附剂上吸附能力较强氧化铝对各化合物的吸附性按以下次序递减：酸>醇，胺，硫醇>酯，醛，酮>烃>卤化物，醚>烯>饱和烃强吸附性的化合物要用强极性溶剂来洗脱作为洗脱剂的溶剂要求其具有一定极性，适合于被分离物的分离，体积尽量要小，此外要求易挥发，易除去(乙醚等挥发性太大的溶剂不合适)洗脱剂的极性按下列次序递增：己烷或石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸装柱要求吸附剂必须均匀填充于柱内，不能有气泡和裂缝，否则将影响洗脱和分离在装柱时，通常把柱子竖直固定好，关闭下端活塞，底部用少量脱脂棉轻轻塞紧，加入 0.5 cm 厚的海砂，然后加入溶剂到柱子体积的 1/4，用一定量的溶剂与吸附剂在烧杯中调成糊状，打开柱下端的活塞，让溶剂一滴一滴地滴入锥形瓶中，同时把糊状物快速倒入柱中，吸附剂通过溶剂慢慢下沉，进大学化学实验7行均匀填充。

柱顶部 1/4 处一般不填充吸附剂：以便使吸附剂上面始终保持一液层柱填充好后，上面再覆盖 0.5 cm 厚的海砂过柱时，首先把试样溶解在最小体积的溶剂中，用滴管将试液加到吸附剂的上面；试液加完并流到吸附剂上端时，立即加入展开剂进行展开，自始至终保持柱内液面高于吸附剂的顶端，否则柱内将出现气泡或裂缝试样中极性小的组分首先被洗脱下来，极性大的组分吸附较强，后被洗脱下来。