动物检验检疫新技术.ppt

现代生物技术和现代信息技术的飞速发展及广泛应用，给动物检疫带来了深刻的影响，为动物疫病的诊断、检测、监测、处理等提供了更为快速、准确和高效的技术与方法本次讲座简要介绍现代生物技术和信息技术基本类别与原理的基础上，重点分析现代生物技术和信息技术在动物检疫领域中的应用，并初步探讨现代技术检疫应用的未来发展现代生物技术及其发展现代生物技术以现代生物学作为理论基础，由生物学、免疫学、化学、物理学、信息学等多种学科理论和技术相互交叉融合而成，其发展与材料、信息、传感器、图像处理、微机电系统等多种技术的发展息息相关，因而现代生物技术已经突破传统生物学的范畴，成为研究现代生物学的必备工具和重要手段基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程,免疫血清学技术基础 分子生物学技术基础,免疫血清学技术基础 免疫学技术是指利用抗原、抗体、免疫组织、免疫细胞、免疫分子等相互作用时发生的特异性反应，同时结合反应组分的特性、标记技术、图像处理技术等建立的检测和分析方法，因而具有较强的特异性和敏感性 免疫血清学技术在动物检疫中应用最广泛，主要包括中和试验、凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、免疫荧光抗体技术，放射技术，免疫技术、免疫酶标记技术、胶体金标记技术、免疫电镜技术。

抗原抗体结合力示意图,抗原,抗体,氢键结合力,,,,ON,,ON,,HH,静电引力,,,,,,--,,,,,++,范得华力,,,,,-+,+-,,,+-,-+,,,疏水作用力,,,,,排斥的水,,构象决定簇和线性决定簇,2、比例性 抗原一般都是多价的，而抗体（IgG）则是二价的，只有二者比例适合时，抗原抗体才能结合得最充分，形成的抗原抗体复合物最多，反应最明显，结果出现最快，此称为等价带（zone of equivalence）如抗原或抗体过多，则二者结合后均不能形成大的复合物，不呈现可见反应，称此为带现象（zone phenomenon），出现在抗体过量时，称为前带（prezone），出现在抗原过剩时，称为后带（postzone）比例性示意图,抗体过量,比例合适,抗原的量,抗原过量,抗体沉淀的量,,,前带,等价带,后带,3、可逆性 抗原与抗体的结合虽具有稳定性，但由于二者之间是非共 价键结合，因此又是可逆的，在一定条件下可解离，且解离后各自生物活性不变抗原抗体复合物的解离取决于两方面的因素，一是抗体对相应抗原的亲和力，二是环境因素对复合物的影响4、分阶段反应 抗原抗体反应可分为两个阶段：第一为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。

第二为可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、pH、温度、补体）的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时5、敏感性 抗原抗体不仅有高度特异性，还具有较高敏感性，不仅可用于定性，还可用于检测极微量的抗原抗体，其灵敏程度大大超过当前应用的常规化学方法但反应的类型不同，其敏感性有很大的差异表,抗原抗体反应的基本类 型 表反应类型 实验技术 检测方法 敏感度,沉淀反应 液相沉淀试验 观察沉淀、检测浊度 +，++++ 琼脂凝胶扩散 观察扫描沉淀线或环 + 凝胶电泳技术 或峰或弧 ++,补体参与反应 补体溶血试验 以裸眼或光电比色仪 ++ 补体结合试验 观察测定溶血现象 +++,免疫标记技术 荧光免疫技术 检测荧光现象 ++++ 放射免疫技术 检测放射性 ++++ 酶标免疫技术 检测酶底物显色 ++++ 发光免疫技术 测定发光强度 ++++ 生物素-亲合素技术 结合其它标记技术 ++++ 金标免疫技术 检测金颗粒沉淀 ++++,凝集反应 直接凝集试验 用裸眼、放大镜或显 + 间接凝集试验 微镜观察红细胞或胶 ++ 凝集抑制试验 乳等颗粒和各种凝集 +++ 协同凝集试验 现象 +++ 抗球蛋白试验 +++,中和反应 病毒中和试验 病毒感染性丧失 + 毒素中和试验 外毒素毒性丢失 ++,凝集反应,直接凝集反应 间接凝集反应,(一)直接凝集试验,玻板凝集反应试管凝集反应,(二) 间接凝集反应(Indirect agglutination test),正相间接凝集试验 (抗原加载颗粒）反相间接凝集试验 （抗体加载颗粒）间接凝集抑制试验间接血凝试验胶乳凝集试验 常用载体颗粒：红细胞、胶乳颗粒,间接凝集反应示意图,,正相间接凝集试验(positive indirect agglutination test),用抗原致敏载体检测标本中相应抗体的方法,反相间接凝集试验(Reverse indrect agglutination),用特异性抗体致敏载体,检测标本中相应抗原的反应,可用于检测乙型肝炎病毒表面抗原\甲胎蛋白\新型隐球菌荚膜抗原等.,间接凝集抑制试验(Indirect agglutination inhibition test),是以抗原致敏的载体及相应抗体作为诊断试剂,用于检测标本中是否存在与致敏载体相同的抗原的试验.若用已知抗体致敏的载体及相应的可溶性抗原作为诊断试剂,以检测标本中的抗体,此时称为反相间接凝集抑制试验,间接血凝试验(indirect hemagglutination test),将可溶性抗原(或抗体)吸附于人的O型红细胞或绵羊\家兔的红细胞制成抗原致敏的红细胞,与相应抗体(或抗原)作用,在有电解质存在的条件下,经过一定时间可出现肉眼可见的红细胞凝集现象.,胶乳凝集试验(latex agglutination),抗原(或抗体)与胶乳结合(致敏)后,直接与待测标本中抗体(或抗原)发生凝集反应,称为胶乳凝集试验.在猪萎缩性鼻炎的检测中应用较多。

该试验的敏感性不及血凝试验.,环状沉淀反应(Ring precipitation test),原理:将抗原溶液叠加在细小玻璃管中抗体溶液上面,因抗血清蛋白浓度高,比重大,在两液交界的清晰界面上形成白色沉淀环为阳性反应.技术要点方法评价:简便快速,但只能定性,敏感性低.Ascoli 反应,(1) 单扩散 * 过程： 制含抗体凝胶板——打孔——加系列稀释的标准抗原及待测抗原——保湿、37OC、一天——结果观察、计算（绘制标准曲线、计算待测抗原浓度,沉淀圈的面积与抗原含量成正比） *用途： 定性分析、定量分析凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation),含抗体凝胶,Ag,Ag,Ag,Ag,沉 淀 环,（2）琼脂双扩散,双向免疫扩散实验又称琼脂扩散实验抗原抗体复合物沉淀线是半渗透性屏障特异性的抗原抗体不会扩散通过沉淀线，但可允许其它抗原或抗体分子自由通过因此，当抗原抗体存在多种系统时，即将出现多条沉淀线以至交叉反应从沉淀线的形状、位置及宽度，还可进一步了解两个反应物的相对浓度及扩散速度，而扩散速度与分子量呈反比，因此，也可间接了解反应物分子量的大小双向双扩散,沉 淀 带,Ab,Ag,Ab,Ag,(3) 免疫电泳测定法 （immunoelectrophoresis） * 免疫电泳与扩散的结合 * 过程：先电泳（制板——凝固前加玻棒——打孔——加抗原、指示剂——电泳）——再双扩散（取出玻棒制槽——加抗体——放入湿盒、37OC、扩散1天）——结果观察。

* 用途：定性、纯度检察、不同组分分析免疫电泳过程,,* 过程：制板——打孔——加抗原、抗体——电泳. * 用途：定性分析，普查 * 优点：较双扩时间短（30—90min）、检查样品多.,对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis）,原理 当抗原和抗体在琼脂介质中电泳时，由于抗体的pH比较高，在适当的pH值下抗体带正电而抗原带负电，故在电场中抗体向阴极方向移动而抗原向阳极方向移动，直至相遇出现沉淀线其原理与双向免疫扩散相同，但具有方法简便、快速及一次电泳可以检测多个品等特点对流免疫电泳,,,,,,,,,,,,,,,结果判定 第一次观察：从电泳槽取出琼脂板，对光观察抗原孔与抗体孔间是否有白色沉淀线，有沉淀线者为阳性，无沉淀线者为阴性第二次观察：”琼脂板置湿盒中37℃保温数小时后观察 如标本需保存可染色与保存注意事项 (1)本试验灵敏度高，有出现假阳性的可能，每次电泳均应设阳性对照、阴性对照，对电泳结果沉淀线模糊不清的样品应重复实验 (2)本试验中抗原和抗体的浓度应接近，如抗原浓度过高，可造成假阴性的结果，需将抗原稀释予以解决。

应用(1)该试验适用于传染病和寄生虫病的快速诊断，如HBsAg的检测，血吸虫、包虫病等的抗体测定样品多时可用大玻板2)本试验还可用于抗血清效价的测定，将抗血清作一系列倍比稀释，与抗原孔间出现清晰沉淀线的抗血清的最大稀释度为该血清的效价火箭免疫电泳,标 准 抗 原,待 测 抗 原,含 抗 体 凝 胶,—,+,试验系统: 抗原 抗体 补体指示系统: 红细胞 溶血素,例1 -NDV(新城疫病毒） 9～11d鸡胚 24～48h鸡胚死亡 -NDV+抗血清 9～11d鸡胚 鸡胚不死亡例2 口蹄疫病毒(FMDV) 4～7d乳鼠 乳鼠死亡 FMDV+抗血清 4～7d乳鼠 乳鼠不死亡例3 FMDV 仔猪肾传代细胞(IB-RS-2)单层细胞 细胞病变(CPU)：变圆、成串、空泡、变形、脱落、裂解FMDV+抗血清 IB-RS-2单层细胞 细胞无病变CPU,,,,,,,,,,,,,用途：1.用已知血清检测病毒 鉴定病毒，诊断病毒病2.用已知病毒检测血清抗体 诊断病毒感染，测定病毒免疫血清效价（中和价）,,,免疫标记技术,用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应；借助荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定；可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；,免疫标记技术,在应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。

因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。