《CR引物设计》PPT课件.ppt

第六章第六章第六章第六章 PCR PCR引物设计及相关软件引物设计及相关软件引物设计及相关软件引物设计及相关软件使用使用使用使用主要内容•引物设计原理•引物设计的优化原则•Primer Premier 5.0 介绍•举例说明引物的设计引物设计原理 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选 引物设计的原则1、引物长度 大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18)的引物；若产物长5 kb，则用24个核苷酸的引 物有人用20～23个核苷酸引物得到40 kb的产物 引物设计的原则2、引物GC含量 GC含量在40%－60%之间，以45-55％为宜这可为有效退火提供足够热 引物设计的原则3、引物Tm 引物所对应模板序列的Tm 值最好72℃左右至少要在55－80℃之间 Tm=2(A+T)+4(C+G) （引物长度在25 bp以下） 对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size 公式中，Size = 引物长度。

引物设计的原则4、引物3’端•引物3’末端和模板的碱基完全配对 •防止一对引物内的同源性 •考虑末端5个碱基的ΔG，最好不要富含G/C •引物3′端要避开密码子的第3位 引物设计的原则引物设计的原则5、选择、选择T引物引物3′端端错配错配时，不同碱基时，不同碱基引发效率引发效率存在着很大存在着很大的差异，当末位的碱基为的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，时，错配的引发效率大大降低，G、、C错配的错配的引发效率介于引发效率介于A、、T之间，所以之间，所以3′端最好选择端最好选择T，避免，避免A 引物设计的原则6、最好在模板最好在模板cDNA的保守区内设计的保守区内设计 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区 引物设计的原则7、引物自身及引物之间不应存在互补序引物自身及引物之间不应存在互补序 列列 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合 引物设计的原则8、碱基要随机分布碱基要随机分布 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列（不应超过3个连续的G或C ），否则容易导致错误引发（False priming）引物设计的原则9、引物应具有特异性引物应具有特异性 引物设计完成以后，应对其进行检测如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了 引物设计的原则10、ΔG值值 ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发 引物设计的原则11、引物的引物的5′端端 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰，引物5′ 端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等 引物设计的原则12、在在DNA测序和测序和PCR中最好用中最好用5′末端稳末端稳定定(如如GC含量较多含量较多)，而，而3′末端不太稳定末端不太稳定(如如AT含量较多含量较多)的引物的引物 Primer Premier 5.0 简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分析使用介绍Preimer Premier 启动界面Load sequence基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好Choose a function 引物设计界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But …引物编辑引物编辑Edit primer hereAnalysis the edit resultAccept the edit result Return to the main window任务任务用绿色荧光蛋白用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白标记蛋白NR1举例说明举例说明SPBamHINR1Plasmid 1:Plasmid 2GFPSPBamHI(GGATCC)NR1-1aGFP 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa NR1的编码序列的编码序列(~4000bp)红色红色为信号肽, 蓝色蓝色为BamHI酶切位点, 下划线下划线标出酶切位点的阅读框 ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAGFP序列(~700bp)引物要求•PCR扩增GFP•GFP两边添加BamHI酶切位点•保证NR1的阅读框不改变5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ 3’ TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5’GFP序列5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ 3’ TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………CGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5’Primer1: 5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………………..AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5’ Primer2Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2: 5’ TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2: 5’ CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….第一步：扩增第一步：扩增GFP基本序列基本序列变性变性, 引物复性引物复性第二步：GC比值；Tm值Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA…………..Primer2: 5’ CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （（GC:60%,Tm：：64））Primer2: 5’ CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （（GC:57%,Tm：：66））第三步：酶切位点Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （（GC:60%,Tm：：64））Primer2: 5’ CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （（GC:57%,Tm：：66））BamHI: ggatccPrimer1: 5’ ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5’ ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC 第四步：阅读框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct…..Primer1: 5’ ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGANR1序列：序列：Primer1: 5’ ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAatgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacctNR1序列：序列：5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ GFP序列cgc gcg gat ccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC ……………………………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG ??ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct插入插入GFP后的组合序列后的组合序列Primer2: 5’ ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCCPrimer2: 5’ gg atc cct CTTGTACAGCTCGTCCATGCC第五步 保护序列Primer1: 5’ GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2: 5’ GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC。