应用VEGF防治肢体严重创伤后骨质疏松的实验研究.doc

1应用 VEGF 防治肢体严重创伤后骨质疏松 的实验研究【摘要】 目的 研究局部应用血管内皮生长因子(vasular endothelial growth foutor，VEGF)防治肢体严重创伤后局部骨质疏松的作用，为临床应用提供实验依据方法 参照 Allen 氏垂直重量打击法(weightdropping，WD 法)制作新西兰家兔桡骨远端严重损伤动物模型将实验动物随机分为实验组(局部注射pHVEGF165 质粒)与对照组(局部应用生理盐水组)，每组各 15 只实验组于伤后即刻局部(桡骨远端周围)注射 pHVEGF165 质粒 50 ug，对照组局部注射生理盐水于给药后 2、4、6、8 周观察桡骨远端血流量及骨密度变化治疗后 8 周处死动物，行病理学检查结果 实验组伤后 2、4、6、8 周血流量优于对照组，桡骨远端骨密度明显高于对照组(P＜0.05)实验组病理学检查见骨小梁增多、增粗结论 局部注射 pHVEGF165 质粒可以改善肢体严重创伤后局部血流量，预防局部骨质疏松的发生 【关键词】 肢体严重创伤；血流量；骨密度；骨质疏松Abstract：Objective To approach the effect of local application of VEGF for curing bone rarefaction after serious limbs crush injury，and to provide experimental basis for clinical treatment.Methods Animal model of New Zealand rabbit′s limbs(distal radius) crush injury were produced with reference to Allen′s vertical combat weight (weight- dropping，WD method) and were randomly divided into experimental group (local injection with pHVEGF plasmid) and the control group (local injecting with normal sodium)，and each group have 15 New Zealand rabbits.Experimental group were injected instantly with 50 ug pHVEGF plasmid after limbs crush injury，and control group were injected with normal sodium.The diversity of regional blood flow and bone density of distal radius were detected after 2，4，6 and 8 weeks after local injection.Then，after 8 weeks，the animals were sacrificed to make pathologic detection.Results Regional blood flow of experimental group was better than that of control group after 2，4，6 and 8 weeks，and bone density of distal radius was so，and 2P＜0.05.There was a significant difference.Pathologic detection showed that bone trabecula of experimental group was increased and thickened more.Conclusion Local injection of pHVEGF plasmid can improve regional blood flow of crush injury limbs and prevent regional bone rarefaction.Key words serious limbs crush injury；blood flow；bone density；bone rarefaction临床上，我们经常遇到严重手外伤后，患者局部骨质(桡骨远端、腕骨、指骨等)出现骨量减少或骨质疏松，这种局部骨质疏松对患者疾病(如骨折，神经、肌腱损伤)的进一步治疗非常不利，常常导致治疗周期的延长及手功能康复不佳。

我们既往研究表明，局部骨质疏松的发生和局部血流量下降有关，皮质骨内微循环血流量下降是导致局部骨质疏松的主要原因经查文献，有关局部骨质疏松治疗的研究未见报道研究表明，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种强有力的血管生成丝裂原，可以促进血管重建，改善局部血流量［1］本实验旨在探讨局部注射 pHVEGF165 真核表达载体，观察其对局部骨密度的作用，为临床应用基因疗法预防局部骨质疏松提供实验依据1 材料与方法1.1 动物模型制作及给药方法 取健康雄性新西兰家兔 30 只，清洁级，体重(2.6±0.2) kg，月龄 4.5～5 个月(由山西医科大学动物实验动物中心提供)，自由进食和饮水，12 h 昼夜节律喂养参照 Allen 氏垂直重量打击法(weightdropping，WD 法)制作肢体创伤模型，用自制改良式 Allen 氏 WD 装置，以右上肢腕关节为中心，采用 100 g 冲击棒自 10 cm 长玻璃管垂直自由下落击于桡腕关节背侧圆形薄铜垫片(直径 1.0 cm，重 0.5 g)上，打击面积 0.35 cm2，致伤量为 1 kg/cm2。

下落撞击后，见兔尾痉挛性摆动、患肢拖动，显示撞击成功随机分为实验组(局部注射 pHVEGF165 质粒)与对照组(局部应用生理盐水组)，每组各315 只实验组于伤后即刻局部(桡骨远端周围)注射 pHVEGF165 质粒 50ug对照组局部注射生理盐水 5 mL1.2 pHVEGF165 质粒的制备 将 pHVEGF165 转化为 E.coli DHα，经挑单克隆，酶切鉴定正确后，保存菌种，并大量培养，提取质粒备用使用时用无菌磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)溶解稀释1.3 观察指标 a)桡骨远端血流量：采用东芝 GCA90B 超大型数字式 γ 照相机检查，将探头对准桡骨远端在肘正中静脉注入 99mTcMDP 0.25 mL，荧屏显示放射性核素到达桡骨远端时开始照相，每秒钟一幅，共 60 幅该系列图像经计算机处理后提供出时间—活动曲线取活动最高峰出现的时间为动脉相再自第 2 min 起每分钟照片一幅，共 9 幅经计算机将 9 幅图像的桡骨远端活度制成斜线，称为静脉相放射性核素在桡骨远端滞留越多，所画出的斜线向上抬高得越高经计算机将两组桡骨远端静脉相计算出斜率用于比较其差异b)桡骨远端骨密度测量：采用法国 DMS 公司的 CHALLENGER 双能 X 射线骨密度检测仪测量桡骨远端骨密度。

c)病理组织形态学检查：各组动物治疗后 8 周处死取右侧桡骨骨松质于 4％多聚甲醛固定 48 h，再用 10％EDTA 在 4℃中脱钙 3～4 周，每周更换 1 次脱钙液(直到组织变软为止)，最后取标本作石蜡包埋切片HE 染色及甲苯胺兰染色进行病理组织形态学观察1.4 数据处理 实验数据用均数±标准差表示，组间差异比较采用 t 检验P＜0.05为差异有统计学意义 2 结 果2.1 桡骨远端血液循环变化 实验组给药后 2、4、6、8 周桡骨远端行 ECT 检查，4动脉相高峰出现时间较对照组缩短，静脉相斜率明显下降(P＜0.05)具体比较见表 12.2 桡骨远端骨密度比较 实验组与对照组相比，给药后 2、4、6、8 周骨密度高于对照组(P＜0.05)具体比较见表 2表 1 桡骨远端动脉相高峰出现时间及静脉相斜率比较表 2 各组桡骨远端骨密度情况2.3 病理组织形态学检查 形态学观察实验组骨小梁增多密集，骨形成表面的成骨细胞呈矮柱状或立方状，骨小梁吸收陷窝显著减少(见图 1)；对照组骨小梁细小、稀疏断裂而不连接，可见有小梁吸收陷窝，骨形成表面的成骨细胞数目增加，细胞变扁平或立方不规则(见图 2)。

3 讨 论Perren 等［1］在接骨板诱发局部骨质疏松的研究中认为，接骨板固定后引起局部血供障碍是导致接骨板下骨质疏松的主要原因Gunst 等［2］对兔完整胫骨接骨板固定后的局部血液循环进行观察，术后即发现板下皮质骨及邻近区域无血流灌注，认为血液循环障碍是导致接骨板内固定术后骨质疏松的原因我们的实验研究表明动脉血流量下降、静脉瘀滞使皮质骨内微循环血流量明显减少及循环障碍是导致严重肢体创伤后局部骨质疏松的主要原因骨质疏松时骨组织中存在血流下降和窦状微血管损伤VEGF 对骨质疏松骨折有非常重要作用血管生成是骨折愈合过程中的重要环节，骨折部位良好的血液供应对骨折修复具有重要意义［3］研究证实 VEGF 在骨形成和骨代谢中的作用，主要是通过促血管生成参与骨发育形式来进行［4］在血管的正向调控中，目前己知多种生长因子和细胞因子对血管的生成具有促5进作用，然而在众多的血管生成因子中，VEGF 是最有力的血管生成因子，通过和血管内皮细胞的特异性受体结合，具有强大的促内皮增殖，促血管生成作用［5］本研究结果显示，肢体严重创伤后即刻局部注射 pHVEGF165 质粒后 2、4、6、8 周桡骨远端局部血流量明显优于对照组。

与此同时，桡骨远端骨密度高于胞和破骨细胞增多，吸收窝增加(HE×100)对照组，差异有统计学意义病理形态学观察实验组骨小梁增多密集，骨形成表面的成骨细胞呈矮柱状或立方状，骨小梁吸收陷窝显著减少这表明血管 VEGF 有利于局部血管网络的建立，增加肢体严重创伤后局部血流量，促进骨的新陈代谢，增加局部骨密度，预防局部骨质疏松的发生因此，VEGF 局部注射可考虑作为促进肢体严重创伤后局部骨质疏松性骨折愈合的一种有效手段，它具有一定的应用前景和临床价值参考文献】［1］Perren SM，Cordey J，Rahn BA，et al.Early temporary porosis of bone induced by internal fixation implants［J］.Clin Orthop，1988，(232)：139151.［2］Gunst MA.Interference with bone blood supply through plating of intact bone［M］ ∥Unthoff HK.Current concepts of internal fixation of fracture.Berlin：Springer，2000：268275.［3］Kordy NM，Weiss JB，Bate A.Endothelial stimulating angiogenic factor in early facture healing［J］.Injury，1996，27(2)：143145.［4］Garcia RM，Toran N，Andaluz P，et al.Vascular endothelial growth factor is expressed in human fetal growth cartilage［J］.J Bone Miner Res，2000，15(3)： 534540.［5］Frelin C，Ladoux A，D′angelo G.Vascula。