荧光原位杂交(fish).doc

FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交）1. 实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法2. 实验原理荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸由于 DNA 分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如 a 卫星、卫星 III 类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法间接标记是采用生物系标记的 dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法3. 实验用具及材料Y 染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL 移液器、20mL 移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温204. 实验方法及步骤1）探针及标本的变性（1）探针变性将探针在75℃ 怛温水浴中温育 5min，立即置0℃，5～10min，使双链 DNA 探针变性2）标本变性①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2 ～3h （经 Giemsa 染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）②取出玻片标本，将其浸在70～75 ℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC 的变性液中变性2～3min。

③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100% 冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥2）杂交将已变性或预退火的 DNA 探针10mL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上 18×18盖玻片，用 Parafilm 封片，置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜（约 15～17h） 由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行3）洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2 ×SSC 中洗涤3 次，每次5min （3）在已预热42～50℃的1× SSC 中洗涤3 次，每次5min4）在室温下，将玻片标本2 ×SSC 中轻洗一下4）杂交信号的放大（1）在玻片的杂交部位加150mL 封闭液 I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min2）去掉保鲜膜，再加150mL avidin-FITC 于标本上，用保鲜膜覆盖， 37℃继续温育40min 3）取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。

4）在玻片标本的杂交部位加150mL 封闭液 II，覆盖保鲜膜， 37℃温育20min5）去掉保鲜膜，加150mL antiavidin 于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40min6）取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min7）重复步骤（1 ） 、 （2） 、 （3） ，再于2 ×SSC 中室温清洗一下8）取出玻片，自然干燥9）取 200mL PI/antifade 染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片5）封片可采用不同类型的封片液如果封片中不含有 Mowiol（可使封片液产生自封闭作用） ，为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久6）荧光显微镜观察 FISH 结果先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC 的激发波长为490nm细胞被PI 染成红色，而经 FITC 标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光由于本实验使用的是 Y 染色体上的特异序列，因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性，即使在末分裂的细胞中，也可以观察到明显的杂交信号照相记录实验结果（图16-1）附录 I FISH 相关溶液的配制1）20×SSC：175.3g NaCl, 882.g 柠檬酸钠，加水至1000mL（用10mol/L NaOH 调 pH 至7.0 ） 。

2）去离子甲酰胺（DF ）：将 10g 混合床离子交换树脂加入100mL 甲酰胺中电磁搅拌30min，用Whatmanl 号滤纸过滤3）体积分数70%甲酰胺/2 ×SSC：35mL 甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL 水4）体积分数50%甲酰胺/2 ×SSC：100mL 甲酰胺，20mL 20 ×SSC，80mL 水5）体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）：65 ℃水浴中融化，4℃或-20℃保存6）杂交液：8mL 体积分数25%DS， 20mL 20×SSC 混合 （或40mL 体积分数50%DS，20mL 20×SSC，40mL ddH2O 混合）取上述混合液50mL，与5mL DF 混合即成其终浓度为体积分数10% DS 2×SSC，体积分数50% DF7） PI/antifade 溶液PI 原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100mg/mL ，取出1mL ，加39mL 双蒸水，使终浓度为2.5mg /mLAntifade 原液：以 PBS 缓冲液配制该溶液，使其浓度为10mg/mL，用0.5mmol/L 的 NaHCO3调 pH 值为8.0取上述溶液1mL，加9mL 甘油，混匀PI/antifade 溶液：PI 与 antifade 原液按体积比1 ：9 比例充分混匀，-20℃保存备用。

8）DAPI/antifade 溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI 储存液，按体积比1:300,以 antifade 溶液稀释成工作液9）封闭液 I：体积分数5% BSA 3mL ，20×SSC 1mL，dd H2O 1mL, Tween 20 5mL 混合10）封闭液 II：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250mL, dd H2O 750mL, Tween 20 5mL 混合11）荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL，20 ×SSC 1mL，dd H2O 3mL, Tween 20 5mL 混合12）洗脱液：100mL 20×SSC，加水于500mL，加 Tween20 500 mL13） TE 缓冲液： pH8.0: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；pH7.6: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；pH7.4: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA14）溶液 I： 25mmol/L Tris HCl(pH 7.4), 10mmol/L EDTA。

15）溶液 II：10% SDS， 0.2M NaOH16）溶液 III：Kac 14.7g, HAc 5.8mL, 加水至50mL17） LB 培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g, NaCl 10g, 加水至1000mL ，用5mmol/L NaOH 调 pH 值至7.0附录 II DNA 探针的制备质粒 DNA 克隆的提取、纯化和鉴定1）用接种环挑取一小块-70 ℃冻存的转化菌，接种于5mL LB 培养基中，37℃剧烈震荡过夜2）将收集到的菌液3000r/min 离心10min ，弃掉上清液3）向菌体沉淀中加入溶液 I300mL, 溶液 II 350mL，混匀后将其置于冰浴中片刻，再加溶液 III 350mL 混匀，加酚和氯仿混合液（体积比为1：1 ）500mL 后充分混匀4）12000r/min 离心10min5）取上清液，向其加入600mL 异丙醇，充分混匀后以12000r/min 离心15 ～30min ，弃掉上清液6）用1500mL 体积分数70%乙醇洗涤沉淀2～3 次，晾干7）用 TE 缓冲液溶解 DNA 沉淀8）加水至200mL，以 Rnase A（终浓度200mg /mL）在50℃水浴中消化30min。

9）加入酚、氯仿和异丙醇（三者体积比25：24：1）溶液200mL 混匀，12000r/min 离心2min10）取上清液，再加入氯仿和异戊醇溶液（体积比为24 ：1）200mL 混匀，12000r/min 离心2min11）取上清液，以20mL 3M NaAc 及500mL 体积分数 100%乙醇沉淀 DNA12）可将上述溶液在-70 ℃放置30min 至1h 以充分沉淀 DNA，然后用12000r/min 离心15min13）将沉淀用1.5mL 体积分数 70%乙醇轻洗，自然晾干14）用 TE 缓冲液溶解 DNA15）取1～2mL 上述纯化的 DNA 溶液，于8.0g/L 琼脂糖/TBE 缓冲液凝胶电泳鉴定 DNA 并检测浓度16）取1mg DNA，用相应限制性内切酶 4～5单位，BSA100～200mg /mL，于37℃水浴中酶解2～4h17）电泳观察，根据酶切片段数量及大小，估计 DNA 克隆插入片段大小附录 III 探针的生物素标记探针的标记可采用 PCR 或缺口平移法来制备，但多数情况下采用缺口平移法来制备该过程包括以DNase I 在 DNA 双链上作用产生缺口并以此作为第二反应步骤的作用赳噗，即大肠杆菌聚合酶 I 自缺口处进行修补合成。

在修补合成互补链时将生物素标记的 d-NTP 掺入，从而复制出带有生物素标记的探针本实验采用缺口平移法，按 GIBCO 公司提供的方法以 biotin-14-dATP 标记探针标记好的探针可以在-20℃下长期保存总反映体积50mL， DNA 1mg,10×dNTP 5mL, 10×Enzyme Mix 5mL其中10×dNTP 为：500mmol/L Tris·HCl(pH 7.8)50mmol/L MgCl2100mmol/Lβ-硫基乙醇 100mg /ml 去除核酸酶的牛血清白蛋白0.2mmol/L dCTP, 0.2mmol/L dGTP, 0.2mmol/L dTTP0.1mmol/L dATP, 0.1mmol/L biotin-14-dATP10×酶混合为：0.5u/mL DNA 聚合酶 I0.075u/mL Dnase I50mmol/L Tris·HCl(pH 7.5)5mmol/L 醋酸镁1mmo。