药效学实验设计.ppt

药效学实验设计吴勇杰 兰州大学基础医学院药理学研究所 甘肃省新药临床前研究重点实验室药理实验设计三原则：l对照controll随机randoml重复replication一．对照（control）l1 自身对照：是在同一个体身上观察给 药前后某种指标的变化，此种对照可减少 个体差异，但不能克服随时间而变的因素 的影响如肝炎有自愈倾向，给药后肝功 好转不一定是药物的作用，故自身对照实 验可能会得出错误结论除非有可靠证据 说明检测指标不随时间而变或同时设组间 对照，否则不宜使用自身对照一．对照（control）l2 组间对照：是实验中设若干平行组，进行各组间比较 这种设计符合平行对照的原则，最为常用l 组间对照实验设计：l 1．正常对照组（或阴性对照组，或空白对照组）：正 常动物，给药物赋型剂给药途径同给受试药组l 2．模型对照组：如制备肝硬化、高血压、心肌梗塞等 不用药物治疗，给赋型剂，给药途径同给受试药组l 3．阳性对照组：制造动物病理模型，给已知药物作对 照一．对照（control）l 阳性对照药的选则：选已知药物，如研究目的是报批新药 ，应选已批准上市的药物作对照；如系理论研究，可选未上市 药物。

所选药物尽量是同类药，以便比较作用强度，或公认的 有效药物，如抗溃疡药研究一般选法莫替丁如抗癌药研究一 般选环磷酰胺l 设阳性对照组的目的：l 考察实验方法的可靠性、稳定性l 考察受试药的作用性质、强度，从而发现受试药的优缺点 l 阳性对照药的剂量选则：如要比较阳性药与受试药的作用 强度，应设多个剂量组如受经费等的限制，也可设一个剂量 组，但此时设阳性对照组的作用只是考察方法的可靠性，不能 得出受试物作用强弱的结论l 阳性对照药的给药途径，如能做到，尽量同受试药组一．对照（control）l要使对照组与实验组具有可比性，必须符 合一致性原则：l除处理因素不同外，非处理因素应均衡一 致（同时、同地、同条件、同种、同批、 同病情）一．对照（control）l在用动物疾病模型（如高血压）实验时， 在动物A的基础上加了处理B高血压，加 上溶媒C，故欲判定药物D的作用，给药 组的设计必须满足下述设计：l模型对照组：A+B+Cl药物实验组：A+B+D一．对照（control）l为了判定实验模型的成功与否，即此指标 的变化（血压升高）是否是由于造型的结 果还是自发性波动，必须另设空白对照组 。

故更完整的实验设计应如下：l空白对照组：A+Cl模型对照组：A+B+Cl药物实验组：A+B+D一．对照（control）l空白对照并不是不给任何处理的对照，而 应施以和受试组相同的操作条件，如动物 的质量、饲养条件、药物溶媒、给药途径 、给药次数、手术过程二．随机（Random）l随机包括随机分组和随机操作l1．随机分组：l 随机分组就是按照机遇原则来进行抽样或分组，其目 的是使一切干扰因素分配到各组时只受纯机遇的抽样误差 的影响，由于机遇对每个组来说是相等的，未知因素可对 每个组产生影响，使每个组的同一指标平行增加或减少， 这就避免了实验者主观因素或其它偏差性误差的影响如 观察药物对大鼠实验性胃溃疡的影响，应先造成大鼠胃溃 疡模型，然后将已成型动物随机分配到各组中，从而避免 了造型过程中人为的影响对于短时内难完成的造型，应 先确定随机顺序，按随机顺序操作，并将动物按随机顺序 分配到各组二．随机（Random)l 随机化手段可用随机数字表，这在一般 统计学书上均可捡索到也可用电脑统计 学软件生成l 近年来提倡均衡下的随机（随机区组法 ），即先将能控制的因素（性别、体重、 病情严重程度等）均衡地分档，然后在每 一档中随机取出等量动物分配到各组，使 哪些较难控制因素（如活泼程度、饥饱程 度、疲劳程度）得到随机安排。

二．随机（Random)l典型分组举例：l 某实验者有小鼠60只，♀♂各半，体重 18-22 g, 欲分为6组，如何分组？l分别将♀♂鼠分开，各一笼，每笼30只l 2．将♀鼠30只按体重分笼，分别为 18g, 19 g, 20 g, 21 g, 22 g,共5笼每笼 有同一体重鼠4-8只二．随机（Random)l 3．按电脑统计软件，生成随机顺序如下 ：l 第一批：6，3，2，4，1，5l 第二批：1，4，5，3，2，6l 第三批：4，5，2，3，6，1l 第四批：2，4，5，3，1，6l 第五批：3，6，1，5，2，4二．随机（Random)l 4.备好6只鼠笼，分别标为A.正常对照组，B.模型对照组 ，C.阳性对照组，D.某药低剂量组，E.某药中剂量组，F. 某药高剂量组l 5. 从18 g笼（如有4只小鼠）开始取小鼠，按第一批随 机顺序，依次放入F组、C组、B组、D组A组和E组各缺1 只鼠，从体重最为接近的19 g笼中取出，依次放入A组和E 组第二批和第五批随机方法依此类推l 重复上述过程，将30只♂鼠随机分入6个实验组中。

分 组结果，各实验组小鼠同性别鼠数量相等，各组平均体重 相近，各组在不同体重档次中的小鼠数相近各组鼠的营 养状态及活泼程度接近二．随机（Random)l2．随机操作：l实验过程如可能受随时间变化而变化的已知和未知因素的 影响，则操作过程的顺序（不论是组间或是组内）也应是 随机的，不应按一固定顺序进行，否则会出现顺序误差 l操作典型错误举例：l某实验者进行抗心肌梗塞实验，60只大鼠，分为6组进行 冠状动脉结扎，分别分为假手术对照组（只开胸不结扎冠 状动脉）10只、模型对照组10只，阳性对照组10只，药物 低、中、高剂量组各10只实验时按组别顺序依次对第1-6 组进行手术二．随机（Random)l错误：该实验各组手术依次进行，未遵照随机操作的原则 ，实验结果可能会受随时间变化因素的影响，如受麻醉、 动物体内生理状态（如血糖水平）的时晨变化、环境的经 时性变化，如室温等这些因素可能导致顺序误差体外 实验如一次操作时间短（如在一个细胞培养平板上的操作 ），对指标不发生影响时，可以顺序操作，此时应严格控 制实验条件，使其稳定不变，特别是环境变化样品数不 宜过多，以便缩短操作时间体外实验如在短时间内分批 进行（如在几块细胞培养平板上的实验），每批均应同时 做对照组，以消除顺序误差。

l正确的操作顺序：共分10批进行第1批手术动物，每组 各做一只（平行操作），各组顺序随机排列第2-10批如 法进行三．重复l药理实验的结果应能稳定地重现出来，重现实 验过程称重复重复有二个含义：一是只做一 批实验，在不同个体身上重复，如每一实验组 要做多只动物，小鼠和大鼠一般每组要在10只 以上，这种重复适合于绝大多数实验另一种 重复的含义是，每次每组做10只 小鼠（体内 ）或4管样品（体外），反复重复3次，这主要 是一些特殊实验的要求，如抗肿瘤药的研究三．重复l 重复时要求每组要有足够的动物数或标本数，不同实 验要求的样本数不同，基本规律是实验个体的指标变异愈 小，则均数的标准差愈小，所需样本数愈小，反之要增大 样本数一般说来，计量资料从每个个体中获得的信息多 ，所需样本数小，计数资料对信息浪费大，所需样本多 预试时对照组与实验组有差别，但显著性检验时P>0.05,可 能系样本数不足所致，正式实验时可增大样本数，如组间 确有差异，样本数增大后可达显著性水平，如组间确无差 别存在，样本数增大后对照组与实验组在预试时出现的差 别就会消失至于增大到多少合适，应参考预试结果进行 统计学运算，运算方法可参考《药理实验方法学》（第2版 ）第177页“实验设计中的样本数问题” 一节。

三．重复l 重复实验时要严格控制实验条件，在各次 重复中使条件尽量前后一致，严防干扰因素对 各批实验的影响应控制的干扰因素包括：（ 1）动物：品系、性别、体重、年龄、饲料、 饲养环境，（2）药物：批号、剂量、溶解度 、稳定性、注射容量、注射速度、酸碱度、温 度、保存条件3）仪器：灵敏度、精确度 、零点飘移、电压稳定性及操作熟练程度 4）环境：室温、气压、湿度、季节，甚至实 验的上午或下午、动物的群养和独养也影响实 验结果四 剂量确定l受试药组：制造动物病理模型，给未知药物l 剂量组：至少设2个剂量组，一般在三个剂量组以上l 剂量的选则：剂量的最终确定，应以预试结果为据 在进行预试时，可参考下列方法：l （1）根据文献资料，参考结构类似药物的有效剂量l （2）根据文献资料，参考本药在其它实验模型中的有 效剂量l （3）参考LD50，主要药效试验时一般应 <1/3~1/5LD50,如有效剂量接近LD50，所测实验结果应 用价值不大l （4）参考药动学数据，从有效浓度推算有效剂量5）参考人用量推算：l 早在十九世纪末年，生理学家Voit 氏等发现虽然不同 种类的动物每kg体重单位时间内的散热量相差悬殊，但都 如折算成每m2体表面积的散热量，则基本一致。

例如马、 猪、狗、大鼠和人的每m2体表面积每24小时的散热量都在 1000 kCal 左右药理学家研究药物在体内的作用时则习 惯于以mg/kg 或g/kg等方式来计算药物的剂量这种办法 行之于同种动物的不同个体时，问题似乎不大；但用于不 同种类动物时，常常会出现严重偏小或偏大，以致无法完 成实验1958年Pinkle氏报告6-MP等抗肿瘤药物在小鼠、 大鼠、狗和人身上的治疗剂量，按mg/kg计算时差距甚大， 但如改为按mg/m2体表面积计算，就都非常接近（见表2-5 ），此后，按体表面积计算剂量的概念逐渐为药理学家接 受，被认为尤其适用于不同动物之间剂量的换算动物的体表面积的一般计算法：l 从体重推算体表面积，一般认为Meeh- Rubner公式较为合适：l A=k(W2/3)/10,000l式中A为体表面积，以m2计算；W为体重，以 g计算；K为常数，随动物种类而不同，小鼠 和大鼠9.1,豚鼠9.8, 兔10.1，猫9.9, 狗11.2, 猴 11.8,人10.6应当指出，这样计算出来的体 表面积仍是粗略估计，不一定完全符合实测数 据l例：试算一体重为1.5 kg的家兔的体表面积 ：l解：A=10.1(15002/3)/10,000l log A= log 10.1+2/3 log 1500－log 10000=－0.8783l A=0.1324 m2 l人或动物之间药物剂量的换算：l 为使用方便，可按“mg/kg折算 mg/m2 的转换因子”进行换算：l由上表可见，按mg/kg剂量折算成等效剂 量，人为小鼠的1/12，大鼠的1/6， 家兔 、猴的1/3，狗的1/2。

l 高低剂量的确定：l 如已知某药的剂量范围，进行药效对比 时，一般选中效剂量；进行拮抗实验或解 毒实验时，剂量应偏高；进行多药协同实 验时，剂量应偏低l量效曲线测定时的多剂量确定：l 一般方法，确定最适剂量时应从小剂量开始（产 生20%左右的疗效），在离体器官上按3倍或10倍 递增，在整体动物上按2倍或3.16倍（√10=3.16） 不同药物有不同的量效曲线斜率，故递增比例不 同，一般应按等比级数递增在预试中确定了最小 有效量A、最大有效量B、欲分组数N的情况下，各 组间的剂量比r可按下式求出l r= l各组剂量分别为a,ar,ar2,ar3,……l例如：如某药A=1 mg/kg, B=10 mg/kg, 剂量组 N=3,则计算剂量比如下：l r= = 3.16l剂量分组如下：l 低剂量组：剂量为a: 1 mg/kgl 中剂量组：剂量为ar: 1×3.16=3.16 mg/kgl 高剂量组：剂量为ar。