第8章液固液液色谱法.ppt

第八章 高效液相色谱法液－固吸附色谱液－液分配色谱宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室主要内容液液- -固吸附色谱法固吸附色谱法 一一液液- -液分配色谱法液分配色谱法 二二正相硅胶反相洗脱色谱法正相硅胶反相洗脱色谱法 三三宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室一、液－固吸附色谱法一、液－固吸附色谱法3精选课件宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室1 1、液－固吸附色谱法的定义、液－固吸附色谱法的定义 v液－固吸附色谱是最早出现的，也是最基本的一种液－固吸附色谱是最早出现的，也是最基本的一种柱色谱类型柱色谱类型 液液︱︱固固吸吸附附色色谱谱 色谱分离是基于吸附效应的色谱法称色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱法，以固体吸附剂为固定为吸附色谱法，以固体吸附剂为固定相，以液体为流动相的色谱法，称为相，以液体为流动相的色谱法，称为液－固吸附色谱法液－固吸附色谱法（（Liquid-Solid Adsorption Chromatography，，LSC），），简称液－固色谱法简称液－固色谱法宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室2 2、液－固吸附色谱法的固定相、液－固吸附色谱法的固定相v优良的固定相填料应具备以下特性：优良的固定相填料应具备以下特性：表面具有极性活性基团即吸附位点；形状适宜，最表面具有极性活性基团即吸附位点；形状适宜，最好成微米级微球形，且粒径分布均匀；多孔性且比好成微米级微球形，且粒径分布均匀；多孔性且比表面积大，载样量大；化学性质稳定；机械强度高；表面积大，载样量大；化学性质稳定；机械强度高；价格合理价格合理 。

宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室v在吸附色谱中，最常用的吸附剂是在吸附色谱中，最常用的吸附剂是硅胶硅胶，其次是，其次是氧氧化铝化铝，此外还有高分子多孔微球（有机胶）、分子，此外还有高分子多孔微球（有机胶）、分子筛及聚酰胺等筛及聚酰胺等 v固定相按固定相按极性极性大小分类如下：大小分类如下： 按极性按极性大小分大小分极性吸附剂极性吸附剂非极性吸附剂：活性碳非极性吸附剂：活性碳酸性吸附剂：硅胶、硅酸镁酸性吸附剂：硅胶、硅酸镁碱性吸附剂：氧化铝、氧化镁碱性吸附剂：氧化铝、氧化镁宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室硅胶的性质硅胶的性质v硅胶表面主要存在着硅羟基（硅胶表面主要存在着硅羟基（Silanol，或称硅醇基），或称硅醇基）和暴露于表面的和暴露于表面的Si－－O－－Si键，另外还有一些硅醇基键，另外还有一些硅醇基可能与水以氢键键合硅羟基的表面浓度在液－固可能与水以氢键键合硅羟基的表面浓度在液－固吸附色谱中很重要，因为人们通常认为硅羟基是强吸附色谱中很重要，因为人们通常认为硅羟基是强吸附位点，而吸附位点，而Si－－O－－Si则是疏水性的则是疏水性的。

自由型硅醇基自由型硅醇基 硅氧烷型硅氧烷型 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室硅胶表面的活性作用点硅胶表面的活性作用点物理吸附水物理吸附水干燥表面干燥表面宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 v硅胶按硅胶按结构类型结构类型分类如下：分类如下： 硅胶硅胶薄壳型薄壳型全多孔型全多孔型无定形无定形球球 形形薄壳玻珠薄壳玻珠 无定形无定形全多孔硅胶全多孔硅胶 球形球形全多孔硅胶全多孔硅胶 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室性能性能薄壳玻珠薄壳玻珠全多孔微粒硅胶全多孔微粒硅胶平均粒度平均粒度/μm30～～405～～10比表面积比表面积/（（m2/g））1.0～～1.5400～～600样品容量样品容量/（（mg/g））0.05～～0.11～～5填充填充干法装柱干法装柱湿法装柱湿法装柱分析速度分析速度慢慢快快薄壳玻珠和全多孔微粒硅胶性能比较薄壳玻珠和全多孔微粒硅胶性能比较 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室（（1 1）无定形全多孔硅胶）无定形全多孔硅胶 v无定形全多孔的填料容易制备、价格低、无定形全多孔的填料容易制备、价格低、粒径一般为粒径一般为5 μm～～10 μm，粒度分布较均，粒度分布较均匀，理论塔板数可达匀，理论塔板数可达50000 /m，比表面积，比表面积约约300 m2/g，载样量大，但涡流扩散大，渗，载样量大，但涡流扩散大，渗透性差，比较难填装出稳定的柱床，一般透性差，比较难填装出稳定的柱床，一般用来做制备柱。

用来做制备柱 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室（（2 2）球形全多孔硅胶）球形全多孔硅胶 v球形全多孔填料外形为球形，常用粒径为球形全多孔填料外形为球形，常用粒径为3 μm～～5 μm，下图为中国科学院兰州化学物理研究所生产的，下图为中国科学院兰州化学物理研究所生产的高纯度多孔球形硅胶电镜照高纯度多孔球形硅胶电镜照放大放大30003000倍倍放大放大50005000倍倍宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室（（2 2）球形全多孔硅胶）球形全多孔硅胶v球形全多孔填料具有涡流扩散小，渗透性好球形全多孔填料具有涡流扩散小，渗透性好的优点；如果是硅胶先做成珠子再堆积而成的优点；如果是硅胶先做成珠子再堆积而成的话，即堆积硅珠，则具有传质阻抗小、载的话，即堆积硅珠，则具有传质阻抗小、载样量大的优点，柱效也更高球形填料外形样量大的优点，柱效也更高球形填料外形对称，比较容易填装出稳定的柱床，是化学对称，比较容易填装出稳定的柱床，是化学键合相的理想载体键合相的理想载体宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室氧化铝氧化铝 v氧化铝与硅胶相似，但对水溶液、酸性或碱性水溶氧化铝与硅胶相似，但对水溶液、酸性或碱性水溶液更加液更加不稳定不稳定，所以，极少用作键合固定相的基质。

所以，极少用作键合固定相的基质v氧化铝适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非氧化铝适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物，尤其适合于分离强离解型的化合物，尤其适合于分离芳香族化合物芳香族化合物v当样品为碱性化合物时，用硅胶分离会造成严重吸当样品为碱性化合物时，用硅胶分离会造成严重吸附，此时可选用氧化铝进行分离，但附，此时可选用氧化铝进行分离，但酸性酸性易离解的易离解的化合物容易在氧化铝上形成化合物容易在氧化铝上形成死吸附死吸附v氧化铝分离氧化铝分离几何异构体能力优几何异构体能力优于硅胶 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室3 3、液－固吸附色谱法的保留机理、液－固吸附色谱法的保留机理 溶溶 质质分分 子子固定相对它的吸附力固定相对它的吸附力 流动相的流动相的““拉力拉力””或溶解或溶解力力 吸附力强而溶解能吸附力强而溶解能力差时，溶质有较力差时，溶质有较大的保留大的保留 吸附力差而溶解能吸附力差而溶解能力强时，溶质有较力强时，溶质有较小的保留小的保留 溶质处于这两相作溶质处于这两相作用力场的平衡之中用力场的平衡之中 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 在吸附色谱体系中，溶剂分子和溶质分子均能被吸在吸附色谱体系中，溶剂分子和溶质分子均能被吸附于吸附剂的活性位点上，当流动相流过固定相时，附于吸附剂的活性位点上，当流动相流过固定相时，样品组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面吸附中样品组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面吸附中心，同时，样品中不同组分分子也在竞争吸附中心。

心，同时，样品中不同组分分子也在竞争吸附中心 v一是由一是由Snyder和和Soczewinski提出的提出的竞争模式竞争模式（（competition model） v二是由二是由Scott和和Kucera提出的溶剂作用模式（提出的溶剂作用模式（solvent initeraction model））——“双层吸附模型双层吸附模型” 两种模型两种模型宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室竞争模式竞争模式 v竞争模式认为在被溶剂平衡的色谱柱中，弱极性或竞争模式认为在被溶剂平衡的色谱柱中，弱极性或中等极性的溶剂分子先被吸附剂吸附，覆盖于吸附中等极性的溶剂分子先被吸附剂吸附，覆盖于吸附剂表面形成单分子层，当溶质分子进入色谱体系后，剂表面形成单分子层，当溶质分子进入色谱体系后，便竞争置换（或顶替）溶剂分子而形成吸附便竞争置换（或顶替）溶剂分子而形成吸附X. 溶质分子溶质分子Y. 溶剂分子溶剂分子s. 吸附剂吸附剂m. 流动相流动相 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室双层吸附模型双层吸附模型 v双层吸附模型假定吸附剂表面先被流动相中极性较双层吸附模型假定吸附剂表面先被流动相中极性较强的组分以双层溶剂分子的形式所完全覆盖，双层强的组分以双层溶剂分子的形式所完全覆盖，双层的结构及形成的程度取决于流动相中极性溶剂的浓的结构及形成的程度取决于流动相中极性溶剂的浓度，溶质通过柱子时与双层溶剂的第二层发生取代度，溶质通过柱子时与双层溶剂的第二层发生取代或缔合而使溶质保留。

或缔合而使溶质保留 X. 溶质分子溶质分子Y. 溶剂分子溶剂分子s. 吸附剂吸附剂m. 流动相流动相 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室流动相流动相吸附剂吸附剂溶质溶质诱导力诱导力 静电力静电力 氢键力氢键力 色散力色散力 电荷电荷转移转移 络合物络合物形成形成 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室v组分分子中的极性官能团与固定相表面上活组分分子中的极性官能团与固定相表面上活性作用点（如硅羟基）之间的相互作用强弱性作用点（如硅羟基）之间的相互作用强弱决定了它的竞争能力，即保留程度的大小，决定了它的竞争能力，即保留程度的大小，这种极性相互作用的强弱归纳如下表所示这种极性相互作用的强弱归纳如下表所示 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室硅胶上各类化合物或官能团吸附强弱的分类硅胶上各类化合物或官能团吸附强弱的分类 样品的吸附样品的吸附 能力能力样品类型样品类型无吸附无吸附脂肪烃脂肪烃弱吸附弱吸附烯烃、硫醇、硫醚、单环和双环芳烃、烯烃、硫醇、硫醚、单环和双环芳烃、卤代烃卤代烃中等吸附中等吸附稠环芳烃、醚类、腈类、硝基化合物和稠环芳烃、醚类、腈类、硝基化合物和大多数羰基化合物大多数羰基化合物强吸附强吸附醇类、酚类、胺类、酰胺类、亚胺类、醇类、酚类、胺类、酰胺类、亚胺类、亚砜类、酸类亚砜类、酸类宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室一般保留规律一般保留规律 ①① F化物＜化物＜Cl化物＜化物＜Br化物＜化物＜I化物；化物；②② 顺式几何异构体比反式几何异构体保留值大；顺式几何异构体比反式几何异构体保留值大；③③ 官能团之间的分子内氢键将使保留值减小；官能团之间的分子内氢键将使保留值减小；④④ 极性基团旁边有庞大烷基存在时，保留值减小；极性基团旁边有庞大烷基存在时，保留值减小；⑤⑤ 环己烷衍生物和甾体化合物的中位取代基比轴端环己烷衍生物和甾体化合物的中位取代基比轴端取代基有更强的保留。

取代基有更强的保留 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室4 4、液－固吸附色谱法的流动相、液－固吸附色谱法的流动相 v液－固吸附色谱中使用的流动相为各种有机溶剂，液－固吸附色谱中使用的流动相为各种有机溶剂，主要为非极性的烃类（如己烷、庚烷），某些有机主要为非极性的烃类（如己烷、庚烷），某些有机溶剂（如二氟甲烷、甲醇、三乙胺等）作为缓和剂溶剂（如二氟甲烷、甲醇、三乙胺等）作为缓和剂加入其中以调节流动相的溶剂强度、极性及加入其中以调节流动相的溶剂强度、极性及pH值，值，即进行所谓正相色谱流动相溶剂极性越大，洗脱即进行所谓正相色谱流动相溶剂极性越大，洗脱能力越强，溶质保留越小；流动相溶剂极性越小，能力越强，溶质保留越小；流动相溶剂极性越小，洗脱能力越弱，溶质保留越大洗脱能力越弱，溶质保留越大宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室己烷己烷环己烷环己烷甲苯甲苯苯苯乙醚乙醚氯仿氯仿一氯甲烷一氯甲烷丙酮丙酮硝基甲烷硝基甲烷乙腈乙腈丙酮丙酮乙醇乙醇甲醇甲醇己烷己烷环己烷环己烷异丙醚异丙醚甲苯甲苯苯苯乙醚乙醚氯仿氯仿一氯甲烷一氯甲烷二氯甲烷二氯甲烷丙酮丙酮乙酸乙酯乙酸乙酯硝基甲烷硝基甲烷乙腈乙腈丙酮丙酮乙醇乙醇甲醇甲醇宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室（（1 1）混合溶剂）混合溶剂 v液固色谱中广泛使用混合溶剂（二元、三元液固色谱中广泛使用混合溶剂（二元、三元体系等），这是因为虽然不同的纯溶剂有不体系等），这是因为虽然不同的纯溶剂有不同的溶剂强度。

但他们不一定是进行液－固同的溶剂强度但他们不一定是进行液－固吸附色谱的最佳溶剂强度，我们可以利用不吸附色谱的最佳溶剂强度，我们可以利用不同组成的混合溶剂获得任意需要的溶剂强度同组成的混合溶剂获得任意需要的溶剂强度 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室流动相主体：弱极性的戊烷、己烷、庚烷等流动相主体：弱极性的戊烷、己烷、庚烷等改改 性性 剂：调节流动相的洗脱强度与峰形剂：调节流动相的洗脱强度与峰形中等极性：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中等极性：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯极性溶剂：四氢呋喃、乙腈、异丙醇、极性溶剂：四氢呋喃、乙腈、异丙醇、 甲醇、水等甲醇、水等 碱性物质：如三乙胺等，分离碱性品，碱性物质：如三乙胺等，分离碱性品， 避免峰拖尾或不可逆的保留避免峰拖尾或不可逆的保留 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室（（2 2）水的影响）水的影响 v硅胶及氧化铝为良好的干燥剂水的含量对硅胶及氧化铝为良好的干燥剂水的含量对该类吸附剂的活度有很大的影响，即使有极该类吸附剂的活度有很大的影响，即使有极微量的水吸附在其表面上，也会使吸附剂活微量的水吸附在其表面上，也会使吸附剂活性大大降低。

性大大降低宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室5 5、液－固吸附色谱的应用、液－固吸附色谱的应用v随着随着HPLC技术的发展，虽然原来许多使用液技术的发展，虽然原来许多使用液－固吸附色谱模式的分离分析被更方便、稳－固吸附色谱模式的分离分析被更方便、稳定的化学键合相所代替，但在以下几个方面定的化学键合相所代替，但在以下几个方面仍有其独特的意义仍有其独特的意义宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室（（1 1）异构体的分离）异构体的分离 v许多异构体使用化学键合相来分离是不可能的或者许多异构体使用化学键合相来分离是不可能的或者是很困难的，而采用以硅胶为固定相的液－固吸附是很困难的，而采用以硅胶为固定相的液－固吸附色谱却很容易分开色谱却很容易分开 图图 液固吸附色谱法拆分苯基丁氨酸衍生物异构体液固吸附色谱法拆分苯基丁氨酸衍生物异构体 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室（（2 2）样品预处理）样品预处理 v许多生物样品可使用经典液－固吸附色谱来许多生物样品可使用经典液－固吸附色谱来进行纯化，除去蛋白质等干扰物，然后再进进行纯化，除去蛋白质等干扰物，然后再进一步以一步以GC或或HPLC等分离分析。

等分离分析 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室（（3 3）制备色谱）制备色谱 v由于硅胶比较便易，所以进行分离比较有利，由于硅胶比较便易，所以进行分离比较有利，同时流动相为有机溶剂，容易挥发，便于产同时流动相为有机溶剂，容易挥发，便于产物提取 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室（（4 4）常用于）常用于HPLC-GCHPLC-GC联用技术联用技术 v由于流动相为有机溶剂，易于气化，所以目由于流动相为有机溶剂，易于气化，所以目前前90%的的HPLC-GC中的中的HPLC部分采用液－部分采用液－固吸附色谱，进行正相固吸附色谱，进行正相HPLC 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室二、液－液分配色谱法二、液－液分配色谱法33精选课件宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室1 1、液、液- -液分配色谱法的定义液分配色谱法的定义液－液分液－液分配色谱配色谱 基于样品组分在固定液和流动相之基于样品组分在固定液和流动相之间间分配系数分配系数不同而分离的色谱法称不同而分离的色谱法称为液为液-液分配色谱法（液分配色谱法（Liquid-Liquid Chromatography，，LLC）。

宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室v流动相极性小于固定相极性的液－液色谱法称为流动相极性小于固定相极性的液－液色谱法称为正正相液－液色谱法相液－液色谱法，如以烷烃作为流动相，以含水硅，如以烷烃作为流动相，以含水硅胶作为固定相的色谱系统正相液－液色谱法适合胶作为固定相的色谱系统正相液－液色谱法适合于分离极性化合物于分离极性化合物v流动相极性大于固定相极性的液－液色谱法称为流动相极性大于固定相极性的液－液色谱法称为反反相液－液色谱法相液－液色谱法，如以水为流动相，烷烃为固定相，如以水为流动相，烷烃为固定相的色谱系统反相液－液色谱法适合于分离芳烃、的色谱系统反相液－液色谱法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物稠环芳烃及烷烃等化合物v这两种系统由于固定液易流失、重复性差，已被键这两种系统由于固定液易流失、重复性差，已被键合相色谱法所代替，但正相液－液分配色谱法在薄合相色谱法所代替，但正相液－液分配色谱法在薄层色谱法中还广泛使用层色谱法中还广泛使用宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室v液－液分配色谱的固定相为涂渍在载体上的固定液液－液分配色谱的固定相为涂渍在载体上的固定液。

涂渍了固定液的载体涂渍了固定液的载体1－流动相；－流动相；2－固定液液膜；－固定液液膜；3－毛细深孔和渗入的固定液；－毛细深孔和渗入的固定液；4－液固界面；－液固界面；5－液液界面－液液界面2 2、液－液分配色谱法的固定相、液－液分配色谱法的固定相 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室(1)(1)载体载体 v原则上，所有多孔性的吸附材料均可作为固原则上，所有多孔性的吸附材料均可作为固定液的载体一般常用硅胶、硅藻土等结定液的载体一般常用硅胶、硅藻土等结构类型主要采用多孔层微珠及全多孔微粒型构类型主要采用多孔层微珠及全多孔微粒型二种 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室多孔层微珠多孔层微珠 柱效好，分析时间短；柱效好，分析时间短；但它的多孔层很薄，但它的多孔层很薄，只能涂渍少量固定液只能涂渍少量固定液（最大涂渍（最大涂渍1~2%），），故柱容量低，柱稳定故柱容量低，柱稳定性也差，因为少量的性也差，因为少量的固定液流失将大大改固定液流失将大大改变保留体积变保留体积 全多孔微粒全多孔微粒 全多孔微粒（如硅胶）全多孔微粒（如硅胶）孔容大（孔容大（≈1ml/g），），可涂渍较多的固定液，可涂渍较多的固定液，涂渍量可达涂渍量可达1 1克固定液克固定液/ /每克载体（称为每克载体（称为100100%涂渍），其柱效比前涂渍），其柱效比前者高，且柱容量高，者高，且柱容量高，柱子稳定性也好。

柱子稳定性也好 载体上涂渍的固定液越多，则因固定液流失载体上涂渍的固定液越多，则因固定液流失对样品保留体积的影响就越不显著对样品保留体积的影响就越不显著宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室理想的载体应该具有如下特点：理想的载体应该具有如下特点：①①孔容大孔容大；；②②孔径应为孔径应为100～～500埃之间埃之间孔径太小，较大的孔径太小，较大的分子可能被完全排阻，而保留时间更短，分离分子可能被完全排阻，而保留时间更短，分离不佳；孔径太大，则固定液易流失，柱稳定性不佳；孔径太大，则固定液易流失，柱稳定性差，由于毛细管作用，固定液在小孔要比大孔差，由于毛细管作用，固定液在小孔要比大孔内保持的好内保持的好理想的载体理想的载体宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室(2)(2)固定液固定液 v固定液可采用气相色谱中常用的某些固定液，如不固定液可采用气相色谱中常用的某些固定液，如不同聚合度的聚乙二醇、甲酰胺、丙撑二醇等然而，同聚合度的聚乙二醇、甲酰胺、丙撑二醇等然而，对这些固定液，适合作为流动相的只有非极性链烃，对这些固定液，适合作为流动相的只有非极性链烃，最多再加入少量（最高最多再加入少量（最高10%）的氯仿，四氢呋喃和）的氯仿，四氢呋喃和其它醚类。

所有常见的洗脱液都是这些固定液的良其它醚类所有常见的洗脱液都是这些固定液的良溶剂但由于许多有机物样品在上述洗脱液中的溶溶剂但由于许多有机物样品在上述洗脱液中的溶解度很小，所以这类体系的适用性是有限的解度很小，所以这类体系的适用性是有限的宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室v液－液分配色谱法的固定液的选择也可参考纸色谱液－液分配色谱法的固定液的选择也可参考纸色谱法中使用的体系或从多组分中萃取已知组分的分配法中使用的体系或从多组分中萃取已知组分的分配体系如在纸色谱里，甾体药物可以在浸渍甲酰胺体系如在纸色谱里，甾体药物可以在浸渍甲酰胺的纸上容易地分离，如果把甲酰胺涂在硅胶上，那的纸上容易地分离，如果把甲酰胺涂在硅胶上，那么甾族化合物就能用高效液相色谱分离，因为甲酰么甾族化合物就能用高效液相色谱分离，因为甲酰胺即使在中等极性的溶剂苯、二氯甲烷中也几乎是胺即使在中等极性的溶剂苯、二氯甲烷中也几乎是不溶解的不溶解的v载体的涂渍采用载体的涂渍采用GC中常用的固定液涂渍方法中常用的固定液涂渍方法宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室3 3、液－液分配色谱法的保留机理、液－液分配色谱法的保留机理v液－液分配色谱法的保留机理是根据样品组分溶入液－液分配色谱法的保留机理是根据样品组分溶入固定相（固定相（s）与流动相（）与流动相（m）达到）达到“平衡平衡”后的分配系后的分配系数数 K 的差异而分离。

的差异而分离m：： 流动相流动相 s：： 固定液固定液Xm：在流动相中的溶质分子：在流动相中的溶质分子Xs：： 在固定液中的溶质分子在固定液中的溶质分子 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室v分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一个分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一个分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似v当流动相体积和固定液体积一定时，物质在当流动相体积和固定液体积一定时，物质在固定液中的溶解度越大，分配系数越大，保固定液中的溶解度越大，分配系数越大，保留时间越长；反之，在固定液中的溶解度越留时间越长；反之，在固定液中的溶解度越小，分配系数越小，保留时间越小小，分配系数越小，保留时间越小 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室4 4、液－液分配色谱法的流动相、液－液分配色谱法的流动相v在液－液分配色谱中，流动相一般采用与固定液性在液－液分配色谱中，流动相一般采用与固定液性质相差很大的不混溶的溶剂为流动相，质相差很大的不混溶的溶剂为流动相，流动相对固流动相对固定相的溶解度尽可能小定相的溶解度尽可能小，因此固定液和流动相的性，因此固定液和流动相的性质往往处于两个极端，例如当选择固定液是极性物质往往处于两个极端，例如当选择固定液是极性物质时，所选用的流动相通常是极性很小的溶剂或非质时，所选用的流动相通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。

极性溶剂v流动相使用前需流动相使用前需预先用固定液饱和预先用固定液饱和，或在分析柱前，或在分析柱前增加预饱和柱，以避免固定液流失增加预饱和柱，以避免固定液流失 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室三、正相硅胶反相洗脱色谱法三、正相硅胶反相洗脱色谱法45精选课件宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室NS/RENS/RE的简介的简介v1975年年Jane首次报道在普通正相硅胶柱上，用强极首次报道在普通正相硅胶柱上，用强极性的水为流动相成功分离了碱性药物性的水为流动相成功分离了碱性药物v1987年年Law研究了这种称之为正相硅胶研究了这种称之为正相硅胶/反相洗脱反相洗脱（（NS/RE）色谱中碱性药物的保留机理，认为其保）色谱中碱性药物的保留机理，认为其保留主要由于离子交换所引起留主要由于离子交换所引起vNS/RE具有不需反相高效液相色谱（具有不需反相高效液相色谱（RP-HPLC）中）中复杂的处理手段、碱性药物保留时间大大缩短及拖复杂的处理手段、碱性药物保留时间大大缩短及拖尾改善、峰形对称等优点，是一种分析中药中的生尾改善、峰形对称等优点，是一种分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物及其代谢物物碱成分，或化学合成的生物碱类药物及其代谢物的简便、有效、理想的方法。

的简便、有效、理想的方法宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室1 1、固定相、固定相v本法采用未改性的本法采用未改性的原形硅胶原形硅胶为固定相，以水性溶液为固定相，以水性溶液作流动相作流动相v以普通硅胶作固定相简单、方便，不需以普通硅胶作固定相简单、方便，不需HPLC众多的众多的键合相就能达到满意的分离效果在高键合相就能达到满意的分离效果在高pH值（值（pH＞＞8）的水－有机溶剂混合液中，固定相稳定，硅胶不）的水－有机溶剂混合液中，固定相稳定，硅胶不溶于高浓度极性有机溶剂溶于高浓度极性有机溶剂—高高pH值的流动相中，可值的流动相中，可使用数月不影响柱效使用数月不影响柱效 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室2 2、保留机理、保留机理vNS/RE对碱性药物的保留主要是由于对碱性药物的保留主要是由于离子交换机理离子交换机理v在高在高pH值的条件下，硅胶表面弱酸性的硅羟基存在值的条件下，硅胶表面弱酸性的硅羟基存在一定的离子化特征，因而硅胶在高一定的离子化特征，因而硅胶在高pH值的情况下可值的情况下可作为阳离子交换剂而许多碱性化合物在高作为阳离子交换剂。

而许多碱性化合物在高pH值值（（pH10）时也能部分质子化，这样）时也能部分质子化，这样NS/RE中具备了中具备了阳离子交换的物质条件阳离子交换的物质条件vNS/RE系统种组分主要系统种组分主要依碱性强弱出峰依碱性强弱出峰，色谱峰的，色谱峰的对称性很好，峰形尖锐对称性很好，峰形尖锐宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室3 3、流动相、流动相vNS/RE法常用的流动相为甲醇－水相缓冲液或乙腈法常用的流动相为甲醇－水相缓冲液或乙腈－水相缓冲液，合适的缓冲剂有三乙胺、硝酸铵－－水相缓冲液，合适的缓冲剂有三乙胺、硝酸铵－氨水、甲酸铵－氨水、高氯酸铵－氨水、醋酸铵－氨水、甲酸铵－氨水、高氯酸铵－氨水、醋酸铵－氨水及磷酸氢二铵－磷酸等，由于氨水及磷酸氢二铵－磷酸等，由于NS/RE利用被测利用被测组分与硅醇基相互作用，因此不需要加硅醇基掩蔽组分与硅醇基相互作用，因此不需要加硅醇基掩蔽剂等特殊添加剂，仅用一、二种洗脱液就能对大范剂等特殊添加剂，仅用一、二种洗脱液就能对大范围内的碱性药物进行分离分析围内的碱性药物进行分离分析宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室4 4、影响色谱保留因素、影响色谱保留因素 ①①保持流动相一定的保持流动相一定的pH值和离子强度，随着流值和离子强度，随着流动相中水的比例增加，洗脱能力减小。

动相中水的比例增加，洗脱能力减小 ②②流动相中三乙胺浓度升高，对含碱性基团组流动相中三乙胺浓度升高，对含碱性基团组分的洗脱能力提高，保留时间缩短三乙胺分的洗脱能力提高，保留时间缩短三乙胺为阴离子竞争离子，用于竞争硅羟基，以消为阴离子竞争离子，用于竞争硅羟基，以消除硅羟基对生物间的吸附除硅羟基对生物间的吸附宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室③③碱性组分的保留随缓冲盐浓度的增加（离子强度增碱性组分的保留随缓冲盐浓度的增加（离子强度增加）而减少，这与典型的离子交换系统类似加）而减少，这与典型的离子交换系统类似 固定相：固定相：Radial-PAK硅胶；硅胶；流动相：乙腈－水（流动相：乙腈－水（60：：40，， pH 7.8））;1.异丙嗪异丙嗪 2. 扑尔敏扑尔敏 3.奎尼丁奎尼丁离子强度对保留的影响离子强度对保留的影响4 4、影响色谱保留因素、影响色谱保留因素宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室④④pH值对值对NS/RE的色谱保留具有两面性随的色谱保留具有两面性随pH值的值的增加，碱性药物的保留先增加后减小增加，碱性药物的保留先增加后减小。

pH对保留的影响对保留的影响固定相：固定相：Radial-PAK硅胶；硅胶；流动相：乙腈－水（流动相：乙腈－水（60：：40，， 4mmol/L NaCl））;1.异丙嗪异丙嗪 2. 去甲麻黄碱去甲麻黄碱 3.奎尼丁奎尼丁4 4、影响色谱保留因素、影响色谱保留因素宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室v在实际操作中流动相的在实际操作中流动相的pH值以值以6～～7为好v原因有三：原因有三： ①① pH太低，硅羟基失去离子交换能力；太低，硅羟基失去离子交换能力； ②② pH值太高，弱碱性药物不易离子化；值太高，弱碱性药物不易离子化； ③③ pH值太高，硅胶在碱性溶液中有一定的溶解度值太高，硅胶在碱性溶液中有一定的溶解度宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室4 4、影响色谱保留因素、影响色谱保留因素⑤⑤由于硅氧烷基的疏水特性，非解离型物质在由于硅氧烷基的疏水特性，非解离型物质在该系统的出峰顺序类似于该系统的出峰顺序类似于RP-HPLC 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室5 5、柱子的培养、柱子的培养 v由于流动相中含有三乙胺，三乙胺吸附在硅羟基上。

由于流动相中含有三乙胺，三乙胺吸附在硅羟基上很难以甲醇清洗，所以每次做完样品，先以很难以甲醇清洗，所以每次做完样品，先以0.1%冰冰乙酸冲洗乙酸冲洗15 min～～20 min，洗去三乙胺，然后再用，洗去三乙胺，然后再用甲醇冲洗甲醇冲洗20 min经这样处理后，柱压可长期保持经这样处理后，柱压可长期保持不变，达到保护柱子的目的不变，达到保护柱子的目的宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室6 6、正相硅胶、正相硅胶/ /反相洗脱的应用反相洗脱的应用 vNS/RE能同时分析极性范围很大的一类药物，且分能同时分析极性范围很大的一类药物，且分离效果好，分析时间短离效果好，分析时间短v在体内药物分析中，在体内药物分析中，NS/RE也是一种良好的分析方也是一种良好的分析方法，法，NS/RE在高浓度极性有机溶剂和高在高浓度极性有机溶剂和高pH值条件下，值条件下，保留主要为阳离子交换机理非解离中性脂类和阴保留主要为阳离子交换机理非解离中性脂类和阴离子成分不被硅胶柱保留，因而在溶剂前沿被洗脱离子成分不被硅胶柱保留，因而在溶剂前沿被洗脱只有在色谱条件下呈阳离子型的碱性胺类药物可以只有在色谱条件下呈阳离子型的碱性胺类药物可以很好地保留，排除了内源性杂质峰地干扰，从而选很好地保留，排除了内源性杂质峰地干扰，从而选择性地分析碱性药物。

择性地分析碱性药物宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室例例v使用使用NS/RE分析血浆中抗疟药氯丙二胍及其代谢物分析血浆中抗疟药氯丙二胍及其代谢物3,4-二氯苯双缩胍和氯胍三嗪，空白血浆对被测物质二氯苯双缩胍和氯胍三嗪，空白血浆对被测物质没有干扰，分析结果满意没有干扰，分析结果满意 氯丙二胍及其代谢物的血浆样品色谱图氯丙二胍及其代谢物的血浆样品色谱图 A 空白血浆空白血浆B（（1））25ng/ml 氯丙二胍，氯丙二胍， （（2））3,4-二氯苯双缩胍，二氯苯双缩胍， （（3）氯胍三嗪，）氯胍三嗪， （（4）内标）内标宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室Thanks for your attention!。