人血清测定实验业立生物.pdf

人血清人血清 ELISA 测定实验测定实验 一、实验目的 利用 ELISA 试剂盒测定人血清中 5-羟色胺 (5-HT)、γ-氨基丁酸 (GABA)、β-内啡肽 (B-EP)、去甲肾上腺素 (NE)、多巴胺 (DA) 的血清浓度 二、实验原理 向预先包被了人 5-HT/GABA/B-EP/NE/DA 单克隆抗体的酶标板孔中加入 5-HT/GABA/B-EP/NE/DA，温育；温育后，加入生物素标记的抗 5-HT/GABA/B-EP/NE/DA 抗体，再与链霉亲和素-HRP 结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物 A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色 颜色的深浅与样品中人 5-HT/GABA/B-EP/NE/DA 的浓度呈正相关 三、实验方法 1、标准品的稀释 标准品与标准品稀释液等体积混合稀释，各试剂盒稀释后样品浓度如下表所示： 5-HT 25 ng/ml 50 ng/ml100 ng/ml200 ng/ml400 ng/ml GABA 0.5 nmol/ml 1 nmol/ml2 nmol/ml4 nmol/ml8 nmol/ml B-EP 10 ng/l 20 ng/l 40 ng/l 80 ng/l 160 ng/l NE 75 ng/l 150 ng/l 300 ng/l 600 ng/l 1200 ng/l DA 0.4 μg/ml 0.8 μg/ml1.6 μg/ml3.2 μg/ml6.4 μg/ml 2、加样： 1) 空白孔 ：只加显色剂 A 和 B，以及终止液，其余各步骤相同。

2) 标准品：加入 50 微升标准品，链霉素-HRP 50 微升 3) 样品孔： 加入样品 40 微升， 抗 5-HT/GABA/B-EP/NE/DA 抗体 10 微升、链霉亲和素-HRP 50 微升 盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37 ℃ 温育 60 分钟 3、将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释为 1X 备用 4、去掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，重复 5 次，拍干 5、 每孔加入显色剂 A 50 微升， 再加入显色剂 B 50 微升， 轻轻振荡混匀， 37 ℃ 避光显色 10 分钟 6、每孔加入终止液 50 微升，测 OD450 四、实验结果 表 1：标准曲线： 5-HT OD450 0.0565 0.4255 0.6495 0.9 1.615 2.79 浓度 ng/ml 0 25 50 100 200 400 GABA OD450 0.038 0.371 0.51 0.8 1.361 2.397 浓度 nmol/ml 0 0.5 1 2 4 8 B-EP OD450 0.036 0.1255 0.1945 0.6665 1.084 2.051 浓度 ng/l 0 10 20 40 80 160 NE OD450 0.045 0.375 0.55 0.8506 1.386 2.475 浓度 ng/l 0 75 150 300 600 1200 DA OD450 0.055 0.57 0.81 1.39 2.452 2.647 浓度 μg/ml 0 0.4 0.8 1.6 3.2 6.4 y = 0.0066x + 0.2262 R² = 0.9900.511.522.530100200300400500OD450浓度浓度 ng/ml5-HT 水平OD线性 (OD)y = 0.2824x + 0.1833 R² = 0.991100.511.522.530246810OD450浓度浓度 nmol/mlGABA 水平OD线性 (OD )y = 0.0128x + 0.0304 R² = 0.991100.511.522.5050100150200OD450浓度浓度 ng/lB-EP 水平OD线性 (OD)y = 0.0019x + 0.1981 R² = 0.990600.511.522.530200400600800100012001400OD450浓度浓度 ng/lNE 水平OD线性 (OD)表 2：计算结果 样品 5-HT ng/ml GABA nmol/mlB-EP ng/lNE ng/l DA μg/ml04 床 梁仁明 05174800 2016-11-01 294.21 4.98 114.73 775.73 3.04 陈爱玉 05209502 2016-12-28 350.50 6.32 96.17 694.15 2.96 06 周如祥 05125416 2016-12-19 157.24 2.93 58.60 798.10 1.74 沈来法 M03873915 2016-11-01 248.37 4.10 87.07 845.21 2.59 06 谢霆芳 05246450 2017-1-12 289.28 5.30 132.00 802.57 2.90 周永元 M1316794 2017-1-1 224.43 4.20 109.46 795.73 2.43 卜灯洪 05197341 2017-1-4 283.22 5.14 122.54 814.15 2.72 龚义康 V15189550 2016-12-21 195.87 2.82 85.59 582.84 2.21 07 床 张长井 05176975 2016-12-9 407.39 7.28 127.93 654.42 3.12 D2 姜方宽 05142413 2016-10-30 188.30 3.26 58.21 709.94 1.86 12 李佳佳 05137946 2016-12-21 187.09 3.19 49.65 760.47 2.06 黄兰炎 05191805 2016-12-11 265.04 4.15 87.97 885.73 2.77 姚锁女 05225413 2016-12-19 461.71 8.05 121.57 596.00 3.19 王焕良 05166705 2016-12-15 401.40 7.21 143.67 669.94 3.44 y = 0.7209x + 0.1903 R² = 0.990300.511.522.5300.511.522.533.5OD450浓度浓度 μg/mlDA 水平OD线性 (OD)缪季良 05197679 2016-12-15 161.10 2.87 77.93 592.57 1.58 06 李翠平 05247966 2017-1-16 174.36 2.66 60.63 413.36 1.95 02 王格寒 05211671 2017-1-10 155.04 2.22 66.17 383.89 1.65 郑有华 05236947 2017-1-5 155.95 3.21 60.35 628.63 1.87 任明兴 2016-10-17 185.12 2.47 73.36 766.26 2.11 黄益墩 05163114 2016-10-30 477.01 8.88 155.86 618.63 2.99 李少忠 05144545 2016-10-30 414.06 7.28 162.15 806.26 3.25 茅建高 05149851 2016-12-16 180.04 2.33 53.83 650.73 2.12 18 赵洪兰 05236235 2017-1-17 427.69 7.64 190.16 771.00 3.24 26 孙立华 05165811 2016-11-30 233.75 4.17 77.70 677.05 2.66 张和保 05236930 2017-1-8 208.15 3.62 81.45 710.21 2.33 周玉虎 05155960 2016-10-30 154.43 2.95 81.92 613.10 1.80 朱全荣 05147635 2016-10-20 187.92 3.56 92.46 761.52 2.08 张小英 05143977 2016-10-24 248.98 3.62 95.78 782.57 2.08 3 宗云才 05178383 2016-11-17 349.59 6.14 126.45 770.47 3.33 12 李佳佳 05137946 2016-12-23 168.00 2.64 89.73 715.73 2.13 12 陈裕兰 05227297 2016-12-25 219.96 3.55 97.93 734.94 2.17 周 新 K00899453 2017-1-6 470.42 9.44 250.67 576.52 3.32 沈 毅 Q0063320X 2016-12-14 140.50 2.45 43.01 443.36 1.72 缪季良 05197679 2016-12-12 138.90 3.02 66.45 559.94 2.10 27 孙莲生 05245957 2017-1-19 189.36 3.83 96.64 783.10 2.37 18 赵洪兰 05236235 2017-1-17 386.33 7.44 184.61 738.10 3.40 迟玉成 05201355 2016-12-14 208.60 3.91 101.53 782.57 2.51 1 黄少定 05168681 2016-11-28 329.28 5.66 148.75 597.57 3.418920 79 1 王加本 05165805 2016-11-18 149.89 1.61 51.02 850.2105 1.96 谢长华 05111617 2017-1-6 229.28 4.58 62.11 717.84 2.86 颜富明 05235045 2017-1-1 279.59 3.30 60.94 786.52 2.32 俞云宝 05172442 2016-11-14 161.93 2.29 59.89 434.42 2.11 周永元 M1376794 2016-12-31 250.12 2.55 66.25 676.52 2.36 陈 弟 05197220 2017-1-9 312.09 4.57046762.54 730.47 2.49 张长井 05176975 2016-12-12 396.86 4.17 64.30 806.78 2.72 唐章其 05228224 2016-12-28 204.96 3.10 64.61 745.73 2.15 6 王焕良 05166705 2016-11-30 364.51 2.16 66.14 777.84 2.76 黄木珍 05236874 2017-1-6 284.06 5.25 64.14 773.89 2.68 2 金昌男 05187892 2016-11-14 189.43 3.29 137.31 868.36 1.89 04 林洪泉 05066488 2016-11-10 222.31 2.86 73.60 665.73 2.17 26 张伯棵 K06475598 2017-1-19 214.06 3.80 57.62 747.05 2.29 D3 潘西安 05245510 2017-1-16 144.21 1.66 58.32 468.10 1.56 24 张学林 05250966 2017-1-19 305.42 5.22 81.06 866.52 2.33 03 俞云宝 05172442 2016-11-10 159.96 1.89 50.04 640.21 1.67 陈小弟 05197220 2017-1-6 234.06 4.76 55.94 658.10 2.24 05 王念政 05217388 2017-1-12 188.07 2.。