细胞贴壁原理.doc

细胞贴壁原理悬浮细胞：细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，这类细胞称为悬浮细胞如淋巴细胞贴壁细胞：在动物细胞培养过程中，必须有可以贴附的支持物表面，其依靠自身分泌或培养基中的贴附因子才能在该表面生长增殖的离体动物的培养细胞兼性贴壁细胞：有些细胞并不严格地依赖支持物，它们既可以贴附于支持物表面生长，但在一定条件下，它们还可以在培养基中呈悬浮状态良好地生长，这类细胞称之为兼性贴壁细胞贴壁细胞分为，上皮细胞型，成纤维细胞型，游走细胞型和多型细胞型，在显微镜下观察时，贴壁细胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不规则的三角形或扇形或其它形态，而且晃动培养液时，细胞不动悬浮细胞漂在培养液中，呈圆形，晃动培养液时细胞也随着漂动贴壁生长的细胞跟悬浮的细胞都有很多种活体体内的细胞当离体置于体外培养时大多数均以贴壁方式生长，主要包括正常细胞和肿瘤细胞，比如成纤维细胞，骨骼组织（骨及软骨），心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺皮肤神经胶质细胞，内分泌细胞，黑色素细胞及各种肿瘤细胞等少数细胞在体外培养是悬浮生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞以及淋巴细胞 体外培养贴壁细胞重要的生长特点有：贴附和伸展以及接触抑制和生长的密度限制。

贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点虽然血细胞如淋巴细胞在活体体内并无聚集的倾向并在体外可于悬浮状态中生长，但是大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长，在体外时这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等细胞附着于底物时并非一种需要能量的过程，一般认为与电荷有关据资料记载，37℃时在2min内细胞之间即可形成键，该键可对0.01%胰蛋白酶起作用且仅发生于细胞之间，而细胞与底物之间则无；8 min后才有稳定的键形成一些特殊的促细胞附着的物质（如层粘连蛋白、纤维链接蛋白、III型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程这些促细胞附着因子均为蛋白质，存在于培养液尤其血清之中在培养过程中，这些带阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上，悬浮的圆形细胞再与已吸附有促贴附物质的底物附着，以后细胞将伸展成其原来的形态一般来说，从底物脱离下来的贴附生长型细胞，不能长期在悬浮中生长而将逐渐退变，除非这是一些转化了的细胞或恶性肿瘤细胞另外，经过无血清驯化后的细胞，会从贴壁生长转到悬浮生长，目前在生物工程制药领域，趋势是使用无血清的悬浮培养为主。

体外培养细胞重要的生长特点有：贴附和伸展以及接触抑制和生长的密度限制贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点虽然血细胞如淋巴细胞在活体体内并无聚集的倾向并在体外可于悬浮状态中生长，但是大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长，在体外时这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等细胞附着于底物时并非一种需要能量的过程，一般认为与电荷有关据资料记载，37℃时在2min内细胞之间即可形成键，该键可对0.01%胰蛋白酶起作用且仅发成于细胞之间，而细胞与底物之间则无；8 min后才有稳定的键形成一些特殊的促细胞附着的物质（如层粘连蛋白、纤维链接蛋白、III型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程这些促细胞附着因子均为蛋白质，存在于细胞膜表面或培养液尤其血清之中在培养过程中，这些带阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上，悬浮的圆形细胞再与已吸附有促贴附物质的底物附着，以后细胞将伸展成其原来的形态一般来说，从底物脱离下来的贴附生长型细胞，不能长期在悬浮中生长而将逐渐退变，除非这是一些转化了的细胞或恶性肿瘤细胞。

———摘自司徒镇强主编的细胞培养一书，具体内容见1.2 培养细胞的特性1、细胞贴壁原理 培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等细胞附着于底物时并非一种需要能量的过程，一般认为与电荷有关据资料记载，37℃时在2 min内细胞之间即可形成键，该键可对0.01%胰蛋白酶起作用且仅发现于细胞之间，而细胞与底物之间则无；8 min后才有稳定的键形成 一些特殊的促细胞附着的物质（如层粘连蛋白、纤维链接蛋白、III型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程这些促细胞附着因子（或贴壁因子）均为蛋白质，存在于细胞膜表面或培养液尤其血清之中在培养过程中，这些带阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上，悬浮的圆形细胞再与已吸附有促贴附物质的底物附着，以后细胞将伸展成其原来的形态一般来说，从底物脱离下来的贴附生长型细胞，不能长期在悬浮中生长而将逐渐退变，除非这是一些转化了的细胞或恶性肿瘤细胞另外，经过无血清驯化后的细胞，会从贴壁生长转到悬浮生长，目前在生物工程制药领域，趋势是使用无血清的悬浮培养为主2、贴壁细胞如何分离下来？ 如果把贴壁的细胞洗下来最常用的办法就是加入胰蛋白酶消化，37℃环境下放置3～5min便可，但是残留培养瓶内的胰蛋白酶对细胞有毒性作用，所以都会添加低浓度的血清以中和胰蛋白酶的。

用超声的办法也可以把细胞分离下来，但是要注意超声的频率不能太大，而且细胞很娇嫩，超声会导致细胞的破裂这是由细胞的性质特点决定的3、是否所有动物细胞都要贴壁生长？ 有些细胞是必须要附着在支持物上才可以生长的，比如肝细胞，胃上皮细胞等等 而有些细胞可以悬浮生长，比如骨髓细胞白，血病细胞等等这些细胞的生长都是需要添加血清的，而不是有些人说的，加入血清后会贴壁体外培养细胞重要的生长特点：贴附和伸展以及接触抑制和生长的密度限制提高羊水细胞培养成功率的方法来自:生物01丁082007-09-27 19:43:46摘要:目的　提高羊水培养的成功率方法　正常羊水保留换液标本,以备复查;异常羊水采用细胞分离技术提取羊水中的有效细胞成分;及时发现污染羊水并进行抗菌处理结果　提高了羊水培养的成功率(994% )并缩短异常羊水的培养时间,解决了部分污染羊水的污染问题(2/3)结论　保留换液标本可有效解决因收集不当而导致无法诊断的问题;细胞分离技术可提高异常羊水细胞培养的成功率并缩短培养时间,污染的羊水也可抗菌后培养成功羊水细胞培养由于技术要求高、难度大、周期长、易污染、分裂相较少、对人员素质要求高等问题而难以普及,但是羊水细胞培养及染色体制备与核型分析是产前诊断染色体病的主要手段。

多年来对羊水细胞的培养及其染色体制片虽不断有所改进,但羊水细胞培养与制片的难度仍没有丝毫降低[1, 7]近年兴起的基因诊断由于特异性强、设备要求高、监测范围窄、实验影响因素多等缺陷仍无法取代羊水细胞培养与核型分析在产前诊断中的价值与地位几年来,我们针对血性羊水、胎粪、胎脂污染及细菌污染等严重影响羊水培养的成功问题进行了一些探索,并取得了比较满意的效果,现报告如下资料与方法1.试剂与器材　一次性无菌离心管和50ml的培养瓶是美国Fancon公司生产的,羊水培养基为美IrvineScientific公司生产ChangMedium C专用羊水培养基,CO2培养箱为FORMAL 3131倒置显微镜为OLYMPUS CKX-412.对象　经产前筛查评估结果为高风险发病率的孕妇或有其它产前诊断指征、孕周在16~27w的孕妇3.羊水采集方法　B超定位后,常规消毒,采用22号PIE穿刺针穿刺,最初用5ml注射器抽取约2ml羊水弃去,再换一20ml注射器抽取羊水约20m,l注入两个1次性的无菌离心管中,标本尽快送实验室接种4.一般羊水的处理方法　正常的羊水与轻度血性羊水以1200~1300rpm离心10min,弃去上清液,保留0. 5ml羊水,轻轻混悬细胞,以备接种用。

5.严重血性羊水的处理　以1200 ~1300 rpm离心10min后,将上清液移入另1无菌离心管中,保留约1ml羊水并混匀,另取1离心管加入约2ml无菌淋巴细胞分离液,再将混匀的羊水细胞悬液1~2ml缓缓加入淋巴细胞分离液的上层,要求分层清晰,以1200~1300 rpm离心10 min后,液体分4层:自下而上依次为红细胞、分离液、羊水细胞、羊水吸取中层薄薄的一层羊水细胞于1离心管中用首次分离出来的羊水上清液洗涤分离出来的羊水细胞2~3次,以除去混入的细胞分离液,最后留下0. 5ml羊水,轻轻混悬细胞,以备接种用严重胎粪、胎脂污染的羊水也可用此细胞分离方法提纯羊水细胞6.羊水细胞培养与制片　将羊水细胞用无菌滴管打匀,接种于50ml塑料培养瓶中,并加入ChangMedium C培养液4m,l用滴管轻轻混匀,盖上瓶盖,切勿拧紧,置于5% CO2培养箱中培养到第5天若观察到有较好的梭形细胞克隆则更换新鲜培养液将原来的培养液及混悬的羊水细胞转入一个备用的无菌小瓶中,封盖仍放入5% CO2培养箱中收获时在培养终止前4h加入秋水仙素,最终浓度为2. 0mg/ml~2. 5mg/ml羊水细胞的收获、制片、显带等操作同传统的方法。

如若收获失败,制片中没有可用于分析的染色体核型,则将备用小瓶中的羊水细胞重新分离接种入细胞培养瓶中并加入新鲜的培养液4m,l后面的步骤同新接种的羊水细胞培养步骤一样7.污染羊水的处理　羊水细胞接种后,前两天每天观察1~2次,以便观察是否有污染,若无污染,则不再观察,若有污染的证据应立即加入广谱抗生素(如阿莫西林或氨苄西林),浓度为10μg/ml~15μg/m,l加入12h后,观察抗菌效果,如果有抗菌效果则再加入1次抗生素,如果抗菌效果不明显,再加入另一种抗生素(如头孢曲松)15μg/ml~20μg/ml每24h加入1次,一般不超过3次(抗生素在体外代谢较慢,药物浓度有累加效果),待有细胞贴壁时马上更换新鲜的培养液,并加入10μg/ml~15μg/ml的广谱抗生素结果1.总共338例羊水标本一次性培养成功率达到99. 4%(2例失败)325例一般羊水收获时间平均为7. 8d,最早的45中国优生与遗传杂志2007年第15卷第6期在第一次换液(第5天)即可收获,最长的为16d2. 9例严重血性羊水均培养成功,前3例未经过处理培养周期为15~33d,经过细胞提纯处理的后6例羊水培养收获时间为7~18d,处理后的羊水贴壁时间明显提前。

3. 4例微生物污染的羊水1例未作任何处理,培养失败;另3例发现污染后立即加入广谱抗生素, 1例因发现较晚培养失败, 2例培养成功,收获时间分别为13d、18d4.收获的336例羊水细胞,每例制备6~8张染色体玻片, 229例可获15个以上可分析的核型;另有7例收获制片后,无法进行核型分析,又将备用瓶中的羊水细胞重新接种,2次或3次培养、收获、制片成功讨论影响羊水细胞培养成功率的因素很多[2, 6],但主要的是培养基的质量和羊水中存活细胞的数量我们应用了多种品牌的羊水培养基,认为美国IrvineScientific公司生产的ChangMedium C专用羊水培养基效果较好,细胞贴壁时间早,生长快对17~27w的羊水培养情况进行分析后,认为羊水的最佳采集时间为18~24w之间18w之前羊水中细胞比较少,贴壁细胞克隆少,收获较晚; 25w之后的羊水有形成分增多,常较混浊,由于有形成分较多(包括大量的死细胞),严重地影响了活细胞的贴壁,因此也造成收获时间延长孕周大的羊水一旦发现几个贴壁克隆时就。