eric-pcr指纹图谱技术在分子生态学中的应用.pdf

实验二实验二 ERIC-PCR 指纹图谱技术在分子生态学中的应用指纹图谱技术在分子生态学中的应用 一、实验原理一、实验原理 1991年，Hulton（6）等人首次在E. coli, Salmonella typhimurium及其它肠道细菌基因组 中发现了ERIC（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus）序列，即肠杆菌基因间保守 重复序列同年，Versalovic等人（8）发明针对ERIC序列设计引物并进行PCR扩增的技术， 以用于对细菌的基因组DNA进行指纹图分析，并将该技术申报专利此后，ERIC-PCR技术 就被广泛应用于细菌分类和菌种鉴别上（2） 1997年，Gillings 和 Holley发现(5), ERIC-PCR可以从植物、脊椎动物、无脊椎动物、 真菌等物种的基因组DNA中扩增出稳定的、多态性丰富的图谱，而这些生物的基因组中是 没有典型的ERIC重复序列的因此，并不需要有ERIC序列就可以获得多态性丰富的、可以 反映底物序列差异的图谱Gillings 和 Holley还进一步证实，ERIC-PCR不是一种专门扩增 ERIC序列的技术，它与其它多种针对重复序列的PCR分型技术，例如REP-PCR、BOX-PCR 等一样，实际上是一种“长引物随机PCR技术(long primer RAPD, LP-RAPD)”（4）。

长引 物随机PCR技术与普通RAPD技术不同之处有两个：1）使用一对长度大于16 碱基的引物， 而不是普通RAPD那样的长度只有8－10个碱基的单个引物；2）退火温度高于52℃，而不是 普通RAPD的低于40℃正是由于这两个特点，这种长引物随机PCR技术与普通的RAPD技 术相比，具有图谱稳定、重复性高，对底物的序列差异敏感性高以及产生的图谱多态性丰富 等特点 1999年，ERIC-PCR首次被用于分析混合菌群（2）Di Giovanni 等用ERIC-PCR分析6 种纯菌组成的混合菌的组成，获得了高重复性的指纹图谱，该指纹图谱与ARDRA及常规 RAPD-PCR相比更能反映菌群的组成特征 Di Giovanni 还用ERIC-PCR成功分析了接种不同 植物根际微生物的BIOLOG GN板不同点样孔中菌群组成的差异（1），提示ERIC-PCR指纹 图谱技术将会成为一项比较细菌群落组成的有效的方法 本实验室经过反复摸索和优化， 首 次将ERIC-PCR方法引入复杂环境微生物群落的研究该方法的理论依据为：用ERIC-PCR 技术研究自然界复杂环境样品，首先需直接提取优质的环境样品中微生物的总基因组DNA， 其中 DNA分子的种类及各分子的相对比例反应了环境样品中菌群的种类数量及种群之间 的相对比例，这样便提取到生态系统中微生物群落结构的组成信息。

不同的环境样品DNA 分子的组成及相对数量不同，重复序列在不同基因组DNA分子中分布及拷贝数均不相同， 这种差异可以反应在ERIC-PCR获得的指纹图谱中在多种细菌组成的微生物群落中，各种 细菌当其种群数量超过总数量的1-10%时，其特征性ERIC-PCR主条带就可以在群落结构 DNA指纹图中表现出来因此，在得到的ERIC-PCR指纹图中，每一条带可以是来自若干种 不同微生物的基因组DNA片段，条带的数目反映微生物类群的多少，每一条带的亮度反映 该类群微生物种群数量的高低，这样，生态系统中微生物群落的结构信息，就被间接地记录 在ERIC-PCR的指纹图谱中因此，分析不同环境样品中微生物混合DNA经ERIC-PCR获得 的指纹图谱的差异， 就可分析比较不同生态系统微生物群落的结构的差异， 或者同一个群落 在不同功能状态下的种群结构的变化情况 本实验室已成功运用ERIC-PCR指纹图谱技术分析人或动物肠道菌群、活性污泥、土壤 等多种微生物群落的结构（1，7，9-13） 高平平等人用ERIC-PCR技术对焦化废水处理系统 中的活性污泥种群结构进行了8个时间点的连续动态研究，发现ERIC-PCR图谱中一条为 2.1Kb的DNA条带的消长与活性污泥的苯酚降解效率表现出一定的正相关，可能是一些主要 功能降解菌的特征性条带（7） 。

对该片断进行回收、克隆、序列多态性分析及测序分析，并 设计了特异性引物， 为下一步用分子生物学方法分离废水处理系统中的主要功能降解菌指明 了方向（10） Wei等用ERIC-PCR指纹图谱技术分析了12个不同个体的人及仔猪的肠道菌群 结构，获得了清晰、可重复的图谱，并显示不同个体具有其宿主特异的肠道菌群的组成，且 健康个体的指纹图谱在一段时间内相对稳定 （9） 潘莉等以ERIC-PCR指纹图谱技术为手段， 比较分析了健康儿童、 临床门诊粪检无白细胞的腹泻儿童和粪检有白细胞的腹泻儿童的肠道 菌群的结构差异，ERIC-PCR图谱分析结果显示腹泻儿童肠道的菌群多样性降低，粪检有白 细胞腹泻个体较之粪检无白细胞腹泻个体肠道菌群失调更为严重， 偏离健康个体的肠道组成 更远（12） 李亮等用ERIC-PCR和其它几种LP-RAPD技术分析了焦化废水接触氧化池中的 悬浮污泥和生物膜上的微生物群落的组成，结果显示这两个群落中微生物的组成差异较大 （11） ERIC-PCR指纹图技术不仅可用于比较分析微生物群落的结构， 也可从分子水平对环 境细菌分离物进行快速鉴定和分类（13，14） ，该方法较之ARDRA等其它分子方法更灵敏， 操作也更简便。

大量研究结果表明， ERIC-PCR指纹图谱技术可成功地分析不同环境微生物群落的组成 并动态监测微生物群落随时间或环境因素的影响而变化的过程，具有快速、重复性强、灵敏 度高等优点，是对目前已经普遍使用的各种16S rRNA基因多样性分析方法的必要补充根 据ERIC-PCR指纹图谱提供的线索，就可以找到一些与功能相关或有特殊生态意义的DNA片 断，或在此基础上结合群落分子杂交技术（详见实验三. 微生物群落结构分析中的分子杂交 技术） 以寻找一些特定微生物群落的 “标记序列” 进一步的实验还可对这些片断进行测序、 设计特异性探针进而进行FISH实验或“序列引导下”的分离，从而可在复杂的环境微生物 群落中找到与某种功能或变化相关的一种或一类细菌因此，发展以ERIC-PCR指纹图谱技 术为基础的一系列分子方法在研究复杂环境微生物群落的组成、 结构与功能的关系以及监测 外界因素对微生物群落的调控等方面具有重要的现实意义和广阔的应用前景 二、实验目的二、实验目的 1. 明确ERIC-PCR技术用于分析微生物群落结构的原理 2. 掌握ERIC-PCR的操作方法 三、实验材料三、实验材料 1． 试剂： 无菌水 25 mmol/L MgCl2溶液 10×扩增缓冲液（不含MgCl2溶液） 2.5 mmol/L dNTP混合液 20 pmol/μl ERIC－PCR引物E1: 5'-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3' 20 pmol/μl ERIC－PCR引物E2: 5'-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3' DNA模板（40-80ng环境样品总DNA） 5 U/μl Taq DNA聚合酶 2． 仪器设备： PCR热循环仪，普通台式离心机，DNA 浓度测定仪，电泳仪，紫外凝胶成像系统， 移液器，200μl无菌PCR小管 四、操作步骤四、操作步骤 1. 取3支200μl无菌PCR小管，分别标记为样品管，阴性对照管和阳性对照管。

2. 在PCR小管中加入以下各种成分： 10×扩增缓冲液 2.5μl 25 mmol/μl MgCl2溶液 2μl 2.5 mmol/L dNTP混合液 2μl 20pmol/L ERIC－PCR引物E1 0.5μl 20pmol/L ERIC－PCR引物E2 0.5μl 模板DNA 40-80ng 加水至24.5μl 注：注：PCR扩增总体系为扩增总体系为25μμl0.5μμl Taq DNA聚合酶在步骤聚合酶在步骤4中加入阴性对照管中以无菌水代替 模板 中加入阴性对照管中以无菌水代替 模板DNA，其它相同阳性对照管以一能得到稳定，其它相同阳性对照管以一能得到稳定ERIC-PCR图谱的已知图谱的已知 DNA作为模板作为模板. 3. 将离心管放入PCR扩增仪，95℃变性7min 4. 从PCR扩增仪中取出PCR小管，迅速加入0.5μl Taq DNA聚合酶，用手指轻弹PCR小管 以混匀反应物，放入普通台式离心机中简短离心，再次放入PCR扩增仪按以下程序进 行扩增： 94℃ 1 min，52℃ 1 min, 65℃ 8 min，共 30 个循环； 65℃延伸 16min，1 个循环。

注：注：ERIC－－PCR采用先高温变性模板采用先高温变性模板DNA，再加入，再加入Taq DNA聚合酶的方法，这样可保证模板聚合酶的方法，这样可保证模板DNA 解链完全并保护解链完全并保护Taq DNA聚合酶的活性，以提高扩增效率聚合酶的活性，以提高扩增效率 5. 待程序结束取出PCR小管吸取2μl扩增产物用浓度仪测定浓度 6. 制备含0.25μg/ml溴乙锭的1％（wt/vol）浓度的琼脂糖凝胶，取300-400ng ERIC-PCR 产物点样，100V电压电泳1-1.5小时 7. 凝胶至于紫外灯下成像，保存凝胶图谱 8. 需要时可用BandMap等软件对指纹图谱进行分析 五、注意事项五、注意事项 2. PCR体系中所有试剂必须保证无其它杂菌DNA的污染制备PCR混合物的操作应在 超净台上进行打开PCR扩增小管时切勿用手指接触管盖内侧用移液器吸取试剂 时要轻吸轻放 3. 平行比较的一批样品进行ERIC-PCR扩增时，必须保证模板DNA的量一致才有比较 的意义ERIC-PCR产物在电泳前需用DNA浓度仪或紫外分光光度计测量浓度，电 泳时应调整点样体积以保证上样量一致 六、参考文献六、参考文献 1. Di Giovanni, G. D., L. S. Watrud, R. J. Seidler, and F. Widmer. 1999. Comparison of Parental and Transgenic Alfalfa Rhizosphere Bacterial Communities Using Biolog GN Metabolic Fingerprinting and Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Sequence-PCR (ERIC-PCR). Microb. Ecol. 37:129-139. 2. Di Giovanni, G.D., Watrud, L.S., Seidler, R.J., Widmer, F., 1999. Fingerprinting of mixed bacterial strains and BIOLOG Gram-negative (GN) substrate communities by enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-PCR (ERIC-PCR). Curr Microbiol 38, 217-223. 3. de Bruijn, F. J. 1992. Use of repetitive (repetitive extragenic palindromic and enterobacterial repetitive intergeneric consensus) sequences and the polymerase chain reaction to fingerprint the genomes of Rhizobium meliloti isolates and oth。