实验二萌发麦苗淀粉酶活性的测定.pdf

实验二萌发麦苗淀粉酶活性的测定生物 112 周泓兆 1102040226 一、研究背景及目的酶作为生物体内最重要的催化剂，其活性尤其受到关注在这次实验中， 我们将对一些经典经典酶活力测定实验进行分析，对比其思路与设计差异，了解测定酶活力的基本方向和实验技巧完成小麦萌发过程中淀粉酶活力的测定并分析测定结果是否合理二、原理淀粉在淀粉酶的催化作用下生成麦芽糖本实验便是通过测定淀粉酶在一定时间内分解淀粉所产生的麦芽糖总量来测定酶的活性根据其催化产物的特点和现有测定方法规定酶活力单位为： 每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数（毫克麦芽糖 * 克-1鲜重 * 分-1） 本实验涉及 α -淀粉酶与 β-淀粉酶，我们可通过钝化β-淀粉酶的方法单独测定α-淀粉酶的活性本实验所使用的3,5 －二硝基水杨酸法是一种对还原糖定量测定的方法还原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比因此， 我们可以测定样品中还原糖以及总糖的量麦芽糖是还原性糖，可用该方法对其含量进行测定三、仪器与试剂1. 仪器： TDL-40B 离心机（上海安亭科学仪器厂），722 光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），DK-S24 型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），JP-100 架盘药物天平（常熟市双杰测试仪器厂），HCTP12A1 架盘药物天平（北京医用天平厂）2. 试剂：麦芽糖标准液，pH5.6 的柠檬酸缓冲液， 3,5- 二硝基水杨酸溶液，0.4M NaOH，Folin-酚试剂甲， Folin-酚试剂乙，标准牛血清白蛋白溶液（1mg/ml ）3. 材料：萌发的小麦种子（芽长约1cm）四、实验方法 /操作步骤1、酶液的制备：称取两克萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置研钵中加少量石英砂，以蒸馏水作为匀浆液， 研磨成匀浆， 转移到 50ml 容量瓶中至40ml 左右，室温浸提15-20 分钟，浸提充分后定容至刻度，混匀后3500r/min离心 20min，取上清液备用（初始酶液）。

2、取 15 支试管，分别编号α- 测定管 1、α- 测定管 2、α- 对照管 1、α- 对照管 2、α+β-测定管 1、α+β - 测定管 2、α+β - 对照管 1、 α+β- 对照管 2 与 1、2、3、4、5、 6、73、在 α- 测定管 1、α- 测定管 2、α- 对照管 1、α- 对照管 2 中各加入酶液1ml 在 70℃恒温水浴中准确加热15min，取出后立即在冰浴中冷却至室温或更低取出后分别在四支试管中各加入 1mlpH5.6 柠檬酸缓冲液，置于40℃恒温水浴中准确保温15min之后向两支对照管中各加入4ml 0.4M NaOH ， 再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml， 摇匀，立即于 40℃水浴中准确保温5min，然后向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4M NaOH，摇匀备用4、取制备的酶液5ml，放入 100ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混合均匀后，在α+β- 测定管 1、α+β- 测定管 2、α+β- 对照管 1、α+β- 对照管 2 中各加入1ml 稀释后的酶液与 1mlpH5.6 柠檬酸缓冲液置于40℃恒温水浴中准确保温15min之后向两支对照管中各加入 4ml 0.4M NaOH ，再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即于40℃水浴中准确保温5min，然后向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4M NaOH，摇匀备用。

5、取编号1、 2、3、4、5、6、7 的七支试管，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0、0.1 、0.3 、0.5 、0.7 、0.9 、1.0ml ，然后将各管用蒸馏水准确补充至1.0ml ，摇匀6、在 α- 测定管 1、α - 测定管 2、 α-对照管1、α- 对照管 2、α+β- 测定管 1、α+β- 测定管 2、 α+β- 对照管 1、 α+β- 对照管 2 与 1、2、3、4、5、6、7 管内各加入1ml 3,5二硝基水杨酸试剂混匀，同时在沸水浴中准确保温5min，取出冷却，用蒸馏水稀释到15ml，混匀7、依次取各试管溶液在520nm波长下进行比色，记录消光值以1、2、3、4、5、6、 7 管消光值作为纵坐标，麦芽糖含量作为横坐标绘制标准曲线，根据标准曲线进行结果计算8、Folin-酚测萌发麦苗水溶性蛋白含量：称取0.5g 萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置研钵中加少量石英砂，以蒸馏水作为匀浆液，研磨成匀浆，转移到50ml 容量瓶中至40ml左右，室温浸提15-20 分钟，浸提充分后定容至刻度，混匀后3500r/min离心 20min，取上清液备用9、取 9 支具塞试管，分别标上待测液1、待测液2、待测液 3 与 F1-F6。

分别在F1-F6 中加 入标准BSA 溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，然后将各管用蒸馏水补充到1.0ml再各取 1ml 上清液（步骤8）于标有待测液1、待测液2、待测液3 的试管中在这九支试管中各加试剂甲5ml，混匀后室温下放置10min，再加试剂乙0.5ml，立即混匀， 30min 后测定各管的 OD650五、数据整理样品标准曲线管号1 2 3 4 5 6 7 OD5200.000 0.062 0.251 0.350 0.454 0.611 0.649 均值管号α- 测定管 1 α- 测定管 2 α - 对照管 1 α- 对照管 2 α +β-测定管1 α+β-测定管2 α+β -对照管1 α+β-对照管2 OD5200.296 0.300 0.159 0.163 0.342 0.336 0.191 0.175 均值0.298 0.161 0.339 0.183 样品标准曲线待测液管号F1 F2 F3 F4 F5 F6 待测液1 待测液2 待测液3 OD6500.000 0.126 0.269 0.356 0.461 0.552 0.556 0.554 0.551 均值0.554 六、结果计算与讨论分析根据数据绘制标准曲线如下：根据标准曲线查得：管号α- 测定管 1 α - 测定管 2 α - 对照管 1 α- 对照管 2 α +β-测定管1 α+β-测定管2 α+β -对照管1 α+β-对照管2 麦芽糖浓度（mg/ml）0.445 0.241 0.507 0.274 结果计算：α- 淀粉酶活性（毫克麦芽糖*克-1鲜重 *分-1）=[(A-A')*样品稀释总体积]/[样品重（ g）*5] =[(0.445-0.241)*800]/[2*5]=16.32（毫克麦芽糖 *克-1鲜重 * 分-1）（α -+ β- ）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖* 克-1鲜重 *分-1）=[(B-B')*样品稀释总体积]/[ 样品重（ g）*5]=[(0.507-0.274)*8000]/[2*5]=186.4（毫克麦芽糖*克-1鲜重 *分-1）A—α-淀粉酶测定管中的麦芽糖中的浓度 A'—α -淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度 B—α-及β-淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度 B'—α-及β-淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度根据标准曲线查得：稀释后溶液的蛋白质浓度（μg/ml） =240.9μg/ml 结果计算：稀释倍数为2g/0.5g=4 ，可得酶液的蛋白质浓度（μg/ml ）=240.9 μg/ml*4=963.5μg/ml （α -+ β-）淀粉酶总比活=（α-+ β - ）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖* 克-1鲜重 *分-1）/[ 酶液的蛋白质浓度（μg/ml ）*酶液总体积（ ml） ]=186.4 （毫克麦芽糖 * 克-1鲜重 *分-1）/[963.5μg/ml*25ml)=7.738U/mg 我们可以看出, 平行数据之间的误差在允许的范围之内, 说明3,5-二硝基水杨酸法测定生成麦芽糖的浓度是可行的。

而α- 淀粉酶活性与 （α-+ β- ）淀粉酶总活性差距极大很可能是因为酶的协助作用，或是一部分有协助分解淀粉作用的酶在70℃时与 β- 淀粉酶一同失活七、结论与展望通过以上的实验方法，我们对淀粉酶的活性进行了测定并且我们发现α-+ β-）淀粉酶总活性远高于α -淀粉酶活性，小麦淀粉酶的总比活为7.738U/mg八、思考题及质疑1． 完成这次小小的蛋白含量测定实验从设计到实施完成的自我经验总结答：这次蛋白实验的主要难点在于蛋白溶液的稀释倍数在设计时我考虑使用浓度梯度的方法来使得稀释后酶液浓度落在工作曲线内，其实实际操作时通过不断稀释即可而且设计实验时我强调 “可溶性蛋白” ， 于是考虑了溶解度的问题，并且设计了12000r/min的离心过程，后来发现这样使得蛋白含量与酶活性之间丧失了可比性（因为离心程度不同了）因此我的经验总结是：联系本次实验设计相关实验，尽可能减少变量的数目2． 从酶活测定的相关实验结果判断本次实验设计的酶活测定样品稀释倍数是否合理？为什么？答：根据我们组和其它小组的经验，本次α- 淀粉酶活性测定结果均靠近甚至稍微超过工作曲线，因此我们觉得应当再稀释一倍后进行测定3． 众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均是采取钝化β - 淀粉酶的活力而测α - 淀粉酶和测总酶活力的策略， 为何不采取钝化α- 淀粉酶活力去测β- 淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什麽？答：钝化 β- 淀粉酶可以采取高温的方法，而钝化 α- 淀粉酶则需要采用酸性环境。

若在实验中采取钝化 α- 淀粉酶的方式，则在将pH调回的的过程中α- 淀粉酶会有很大一部分复性而高温处理后立即冰浴，则可以大大减少β- 淀粉酶的复性其次，在实验中， 酶对 pH更加敏感，若酸过量则会导致β- 淀粉酶也被钝化，相对而言，温度更加易于控制这种设计思路说明我们在实验设计时要考虑其在操作时的合理性，使实验操作尽可能简便4． α- 淀粉酶活性测定时70℃水浴为何要严格保温15 分钟？保温后为什么要立即于冰浴中骤冷？而经如此处理，为什么在随后的40℃温浴和酶促反应中就能保证β- 淀粉酶不会再参与催化反应答，保温时间过短 β- 淀粉酶失活不完全，时间过长导致α- 淀粉酶也有一部分被钝化，所以要严格保温15 分钟立即于冰浴中骤冷是为了减小β- 淀粉酶在降温过程中的复性经过巨大的温度变化，不耐高温的β- 淀粉酶会彻底失活，所以在随后的40℃温浴和酶促反应中就能保证 β-淀粉酶不会再参与催化反应5． 酶的最适反应温度（一般都是生理温度）和最适保存温度（一般0℃以下）为什么不一样？而这两个状态都是需要维护酶的空间结构答：最适反应温度时，酶的结构最适合诱导底物与之结合形成酶-底物复合物，因此体现出酶的活性最强。

而在最适保存温度时，酶的稳定性最好，催化能力很低，从而很好地保存了酶的活性6. 为什么 3，5- 二硝基水杨酸与还原糖的反应要先沸水浴然后再稀释测定？答：原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物因此在沸水浴时，溶液浓度越大反应越完全而在比色法测定时，浓度过大无法测定，因此需要稀释以后进行测定，使数据尽可能符合朗伯-比尔定律7. 在设计酶活测定的实验时，要求酶促反应初速度对底物浓度的小量变化不敏感，具体要求为：在底物浓度有10% 的变化幅度范围内，而所测初速度的变化幅度小于1% 则 [S]/Km应该大于多少才能保证这一点？（设定为米氏酶）答：根据米氏方程：v=(Vmax[S])/(Km+[S]) ，根据题意： 0.9[S] ≤[S']≤1.1[S] ，则 0.99v ≤v' ≤ 1.01v, 计算可得： [S]/Km＞8.18 8. 转氨酶在细胞内的作用及生理意义？细胞内有众多的转氨酶，但相关研究及医学临床应用中却几乎都是只检测谷丙转氨酶（GPT ）和谷草转氨酶（GOT ）的活力，而极少测定其它转氨酶活力，你推测可能的原因会是什么？为什么？答：转氨酶在细胞内催化酮酸与氨基酸或氨基酸之间的转氨基反应，可以生成非必须氨基酸或产生。