免疫组化(IHC)标准化.doc

免疫组化（IHC）标准化 云南省第三人民医院病理科 徐开军免疫组化（IHC）是病理诊断的主要辅助手段之一虽然免疫组化在各个实验室已经常规开展，但是由于各个实验室选择的抗体试剂厂家、抗原修复方法、检测系统等不同，免疫组化实验技术操作方法亦不相同，染色结果会出现各种差异免疫组化染色技术操作步骤看似简单，但步骤较多且环环相扣，而且许多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否熟练掌握整个实验的操作程序、抗体的特异性、检测方法的敏感性、组织标本的固定、抗原的修复及修复液的 PH 值等众多因素所以，完成一张满意的免疫组化切片并非那么简单20 世纪末，非生物素型聚合物（ Polymer）检测系统的出现，可以有效地防止内源性生物素的干扰，而且灵敏度高，操作便捷，已被免疫组化实验室广泛应用当前，免疫组化技术标准化的讨论是建立在由福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片并使用非生物素型聚合物检测方法的基础上而展开的1、免疫组化染色前的处理：组织的固定、取材、脱水、包埋、切片与展片、烤片、脱蜡1）组织的固定：固定的目的是防止组织、细胞自溶与腐败，凝固或沉淀组织、细胞内物质，以保持组织和细胞固有形态和结构对免疫组化而言更重要是保存组织、细胞内的抗原，防止抗原破坏和弥散。

需高度重视的是手术或穿刺离体组织必须马上放于标本袋固定，固定后应与病理申请单及时送交病理科病理医生有责任与手术送检科室进行必要的配合与沟通，避免手术后的病理标本随意丢放由于免疫组化的固定剂种类较多，性能各异，不同抗原其稳定性各不相同，因此，要了解不同固定剂的特征常采用甲醛、戊二醛、Bouin、B5 等固定液由于中性缓冲福尔马林渗透力强、组织收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，提高免疫组织化学检测的阳性率，因此推荐作为病理标本的首选固定液应避免使用含重金属的固定剂10%中性缓冲福尔马林配制方法： 40%甲醛 100ml磷酸二氢钠 4g磷酸氢二钠 6.5g蒸馏水 900ml固定液的量一般为组织块总体积的 5-10 倍，小标本固定时间为 4-6 小时，大标本为 18-24小时固定时间不宜超过 24 小时，以防止组织经甲醛过度固定造成的组织抗原损失和抗原活性降低2）取材：组织标本的取材厚度一般为 0.3cm(不应 >0.5cm)，面积一般为（1.0-1.5）cm x (1.0-1.5)cm3）脱水：组织在脱水机中的处理需十分恰当，大量的实验室经验公认加热抗原修复过程中组织脱片的主要原因是取材过厚以及脱水浸蜡处理不当所致。

4）包埋与切片：组织经过脱水、透明及浸蜡后，进行石蜡包埋包埋的石蜡过热或温度过高容易导致组织抗原的破坏，尤其对于固定不佳的组织，需选用低熔点的石蜡（熔点、稀释度及温育时间等）使用一种新抗体时，必须首先摸索出最佳滴度，所谓最佳滴度就是能获得最佳特异反应所需抗原的最低浓度或者按照有关说明书的提示2）稀释：①一般用 0.01M PBS，PH 值 7.2；②或用 0.05M TBS，PH 值 7.6；③必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白3）保存：合理地保存使用抗体十分重要，这样才能最大限度地发挥抗体的作用，使抗体不致在短期内失去活性①浓缩型抗体：应先根据厂家提供的效价，将其分类可按 5ul、10ul、20ul 等至 100ul 为一单位分装入安瓿或 0.25ml 带盖塑料离心管中，并注明标记（批号、名称、效价、量），密封后放入-20°C — -40°C 低温冰箱中保存，用时按需用量取出，稀释后置 4°C 冰箱保存使用，切勿反复冻存，以免效价降低②即用型抗体可置于 4°C 冰箱中保存远程运送，路途携带，邮寄抗体时，应加冰、干冰、防湿材料，以免影响效价3、免疫组化中被测组织的抗原修复（1）组织细胞经 10%中性缓冲福尔马林固定后，其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，抗原结构的理化性质发生显著的改变，表位空间结构改变而导致许多抗原免疫活性丢失，影响了抗原的定位。

目前在免疫组化实验中，抗原修复是影响染色结果的最关键因素之一常用的抗原修复方法是加热抗原修复法和酶消化法有些抗体不需要进行抗原修复，有些抗体需要酶消化法，有些抗原需要加热修复法，有些抗体则需要几种抗原修复技术的联合应用（抗原双重修复法），至于哪种抗体是否需要抗原修复以及如何修复，一般试剂公司在产品目录或说明书上会予以说明2）酶消化法：现免疫组化实验室中主要是胰酶消化法和胃酶消化法①胰蛋白酶消化法：浓度一般是 0.05-0.1%，37°C 下温育 15-30 分钟②胃蛋白酶消化法：浓度一般为 0.04%，37°C 下温育 10-30 分钟3）加热抗原修复法：主要包括：高压法、微波法、水浴法英联邦免疫细胞化学室间质控组织（UK NEQAS-ICC）进行过一项由 105 家实验室参与，历时两年（1996 年 8 月-1998 年 8 月）的研究对 ER、PR 进行 8 次循环反馈实验，进行不同实验室间实验方法的比较的结论，就目前实验室间 ER、PR 染色结果偏弱的原因最终得出一致性实验结论，即由于微波加热时间不足与实验室中操作控制不当所致，故强烈推荐使用高压抗原修复方法抗原修复必须使用耐高温塑料切片架，不能使用铜染色架，以防止因修复液 PH 值改变抗原修复效果，修复结束后必须等修复液冷却至室温后，才能取出切片，取出后的切片需要用自来水充分洗涤，修复液的量必须保证所有切片都能浸泡到，无论哪一步骤都不能使切片干燥。

用过的柠檬酸修复液或 EDTA 修复液不建议反复使用影响抗原修复的基本因素是加热的温度和时间以及加热处理时浸泡切片的抗原修复液的 PH4）抗原修复液的选择：加热抗原修复液有多种，如柠檬酸修复液（PH6.0）、EDTA 修复液（PH8.0-9.0）、EGTA（PH9.0 ）、Tris 修复液（ PH10.0），至于需要哪种修复液，应该根据试剂公司提供的产品目录或说明书上的预处理方法4、防脱玻片的制备：由于免疫组化过程长，组织切片长时间浸泡在缓冲液和试剂内经过多次冲洗浸泡和作用，尤其是在抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等因素的影响，极易造成脱片，因此，必须在载玻片上涂上粘附剂，增加切片的粘附作用一般采用多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）和 APES 两种粘附剂①多聚赖氨酸防脱玻片的制备多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine ） 1 份蒸馏水 9 份配制方法：取多聚赖氨酸 1 份，蒸馏水 9 份，置于干净的玻璃容器中，混合均匀，将充分洗净、预先干燥的玻片浸泡入稀释好的多聚赖氨酸中 5-10 秒，取出放置于室温下晾干或60°C 干燥箱内烘干备用。

处理后的玻片避光干燥可长期保存、备用浓缩多聚赖氨酸液室温（18-26°C）贮存，有效期 12 个月稀释后的工作液 2°C-8°C 冰箱保存，有效期 3 个月②APES 玻片的制备：APES 1 份丙酮 50 份配制方法：取 APES1 份，丙酮 50 份，置于干净的玻璃容器中，充分搅拌均匀将洗净的玻片放入稀释好的 APES 液中 20-30 秒后取出，稍停，在放入纯丙酮液洗去多余的 APES液，置通风橱中晾干即可注意，用 APES 防脱玻片处理玻片捞片时组织应一步到位，不要留有气泡浓缩液室温（18-26°C）贮存，有效期 12 个月Poly-L-Lysine（多聚赖氨酸）为目前免疫组化染色工作中最常用且效果最好的一种防脱片剂，多聚赖氨酸溶液也可按 1：10 稀释成工作液，适合于需要酶消化、微波、高压的防脱片处理5、免疫组化染色：（1）内源性过氧化物酶的阻断：在一些细胞中存在过氧化物酶和过氧化氢酶等，它们能使H202 分解，DAB 沉积而着色，最常见的是红细胞（血红蛋白），另外还有横纹肌细胞（肌球蛋白）、粒细胞和单核细胞（细胞色素）、肝细胞和肾细胞（过氧化氢酶），如果不进行处理，组织中红细胞、粒细胞等会干扰染色结果的判断，消除内源性过氧化物酶干扰的办法就是将组织切片浸泡在 3%的 H2O2 中 10 分钟。

2）内源性生物素的阻断：抗原修复对组织中内源性生物素受到不同程度的封闭，在加热抗原修复增强抗原表位暴露的同时，也增强了组织中内源性生物素的呈现内源性生物素指的是组织内能够与抗生素蛋白结合的分子或基团，使用生物素-链霉菌抗生素蛋白的结合形成足以以假乱真的阳性周小鸽等人 2002 年采用组织芯片技术对大范围的正常组织和肿瘤组织进行的系统性研究显示：①冰冻组织中存在生物素，② 经福尔马林固定石蜡包埋后的组织中生物素被封闭， ③加热抗原修复可造成生物素暴露，④生物素暴露的强度各不相同，强者可到强阳性（+++ ），⑤生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中，⑥生物素在组织中的分布形式，特别是腺上皮组织，包括正常组织和肿瘤组织，亦存在部分非上皮组织，⑦生物素暴露的强弱与修复液亦有关， PH9.0EGTA 的暴露能力比 PH8.0EDTA 和 PH6.0 的柠檬酸更强；⑧加热抗原修复暴露的生物素可以被蛋清液封闭周小鸽等人提出建议：凡采用加热抗原修复和生物素相关检测系统，应进行生物素常规封闭，冰冻切片做免疫组化染色时亦应进行生物素常规封闭，或者采用非生物素检测系统，如 Envision 等，坚持使用阴性对照。

在实验室中一般凡进行加热抗原修复处理并准备使用生物素-抗生素辣根过氧化物酶检测系统，免疫组化染色的组织都需要进行内源性生物素封闭处理阻断内源性生物素的方法是采用卵白素-生物素（Avidin-biotin）加以封闭，在常温下孵育 20-30 分钟即可，Avidin-biotin 可以与组织中内源性生物素结合，以消除影响但最简便的方法是使用非生物素的酶聚合物检测系统3）血清封闭：作为检测试剂的抗原蛋白带有一定的负电荷，免疫组化染色时，易与带正电荷的组织（特别是纤维组织、变性和 坏死的细胞、嗜酸性粒细胞等）发生静电吸引而导致非特异性染色（实验室使用的封闭血清，一般在加一抗之前使用，选择的血清种属一般与二抗的种属相同），去除这种非特异性染色最有效的方法是，在滴加一抗前，先滴加用于制备第二抗体动物的非免疫血清或滴加除制备第一抗体动物以外的其他动物非免疫血清，浓度为 1：5 —1：20，正常血清保护作用时间 10-20 分钟4）冲洗缓冲液：实验室中常用冲洗缓冲液为 PBS 和 TBS（PH7.2-7.4 ）冲洗缓冲液中加入 0.025%Tween-20 可以增强缓冲液的效果5）一抗孵育： ①即用型第一抗体可按照厂家提供的实验操作条件进行实验（迈新实验室针对即用型抗体稳定性与长期有效保存条件的问题进行了长达 1 年时间对照追踪实验观察,结果表明:即用型抗体在 4°C 冷藏条件下存放 14 个月是稳定的）;②浓缩型抗体一般按照厂家提供的建议稀释度进行成倍稀释预实验,以选择最佳稀释度。

抗体的最佳稀释度是指 :在无背景染色的情况下,获得最佳强度阳性信号的抗体稀释度一般染色背景深大多是抗体浓度过浓所致③抗体孵育时的温度一般以 25°C±8°C 为准，在此区间内，一抗的孵育时间为 30-60 分钟若温度较低应适当延长孵育时间，反之要适当减少孵育时间，或者在 4°C 冰箱过夜，冰箱 4°C 下孵育常需要注意的是：抗体孵育应在潮湿密封闭的环境中进行，避免抗体水分蒸发造成抗体的浓缩或干燥，致使染色背景产生高质量的孵育盒是免疫组化的必要实验用品免疫组化染色过程的试剂浓度，孵育时间是相关联的，浓度与温度和时间基本呈反比，即浓度过高孵育，温度应越低，孵育时间应该越短，反之亦然，因此，每个实验室应根据各自的情况，合理处理三者的关系，摸索出一套适合自己的工作条件6）常用检测系统：目前常用的检测系统为。