实验9,10酶切和连接.ppt

在体外将两个或多个来源相同或不相同的DNA片段连接 成新的重组DNA分子 再转到特定宿主细胞中进行自主复制 并表达 这是分子生物学中的基本技术 DNA克隆 重组 技术 DNA克隆 重组 技术的基本程序包括 1 获得外源DNA 外源DNA是进行DNA重组的目的 DNA片段 一般采用DNA聚合酶链式反应 PCR 或逆转录 DNA聚合酶链式反应 RT PCR 基因组文库或cDNA文库 筛选等方法获得 2 载体的构建或选择 分子生物学中用的载体是指能在 特定宿主细胞中自主复制的DNA分子 例如细菌的质粒 噬菌体 病毒等 常用的载体一般为质粒 根据需要可直 接从公司购买合适的载体 也可以自己构建 3 连接 目的DNA片段和适当载体的连接 一般 采用核酸内切酶分别消化DNA片段和载体 使它们 的末端能够连接到一起构成重组DNA分子 由于所 用内切酶的切割特点不同 产生三种连接方式 粘 端连接 平端连接和不相配的连接 4 转化 将连接的重组DNA产物导入合适的宿主 细胞 使其在宿主细胞内复制扩增或表达 赋予宿 主细胞新的生物特征 5 克隆化 重组DNA分子转化大肠杆菌后 在平 板培养基上筛选出单个菌落 此菌落经过酶切鉴定 或杂交实验后确定为含重组DNA分子的单克隆 DNA克隆 DNA克隆的技术路线大致 包括以下几个程序 分离制 备待克隆的DNA片段 目的 DNA 选择合适的载体 在体外连接目的DNA和载体 将重组DNA分子转入宿主 细胞 并筛选和鉴定阳性重组 子 扩增阳性重组子 实验九 质粒酶切与鉴定 一 实验目的 1 了解质粒酶切鉴定原理 2 掌握核酸片断回收纯化操作技术 3 学习核酸片断连接的原理和方法 二 实验原理 质粒酶切与鉴定 使用限制性内切酶获得粘性末端的目的基因 n核酸限制性内切酶是一类能识别双链 中特定 碱基顺序的核酸水解酶 这些酶都是从原核生物中 发现 它们的功能犹似高等功物的免疫系统 用 于抗击外来 的侵袭 n限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯 键 产生的 片段 端为 端为 限制性内切酶是一种工具酶 这类酶的特点是具有能够识 别双链DNA 分子上的特异核苷酸顺序的能力 能在这个特异 性核苷酸序列内 切断DNA 的双链 形成一定长度和顺序 DNA 片段 如 Not I的识别序列和切口是 限制性内切酶切口 酶切片段 电泳凝胶的区带数 酶切片段大小 三 仪器和试剂 1 主要仪器 1 1 5mL塑料离心管 2 微量加样器10 L 100 L 1 000 L 各一支 3 台式高速离心机 20 000r min 4 水浴锅 5 电泳仪 电泳槽 2 材料 大肠杆菌DH5 质粒 3 3 试剂 试剂 1 1 限制性内切酶 限制性内切酶Not INot I及相应的缓冲液 及相应的缓冲液 2 2 电泳试剂 电泳试剂 1xTBE 1xTBE 缓冲液缓冲液 EB EB 染色液染色液 0 5 g mL 0 5 g mL 四 操作步骤 1 1 反应体系的建立 反应体系的建立 在一无菌在一无菌1 5 ml Eppendorf1 5 ml Eppendorf管中加入 管中加入 无菌双蒸水无菌双蒸水 10 5 l10 5 l 10 10 酶切缓冲液酶切缓冲液 2 l2 l 质粒质粒DNA 100 ng l 7 lDNA 100 ng l 7 l NotNot 10U l 0 5 l 10U l 0 5 l 总体积为总体积为20 l20 l 轻轻混匀 轻轻混匀 12000 rpm12000 rpm离心离心5 sec5 sec 操作注意事项 操作注意事项 1 1 吸样量一定要准确吸样量一定要准确 2 2 加样按体积从大到小 最后加加样按体积从大到小 最后加酶酶 3 3 要求在冰上操作 并充分混匀 要求在冰上操作 并充分混匀 4 4 开启开启EppendorfEppendorf管时 手不要接触到管盖内面 以管时 手不要接触到管盖内面 以 防污染 防污染 5 5 样品在样品在37 37 与与65 65 保温时 将离心管盖严 以防保温时 将离心管盖严 以防 水进入管内造成实验失败 水进入管内造成实验失败 2 37 2 37 水浴水浴1 h1 h 3 3 将将EppendorfEppendorf管置管置65 65 水浴中水浴中10 min10 min 通过加热使酶失 通过加热使酶失 活以终止反应 活以终止反应 4 4 DNA DNA 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测 1 1 水平放置胶槽 放入合适的梳子 水平放置胶槽 放入合适的梳子 2 2 1 1 琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖凝胶的制备 称取0 3g 0 3g 琼脂糖 置于琼脂糖 置于 三角瓶中 加入三角瓶中 加入30 mL TBE 30 mL TBE 缓冲液 微波炉加热融解 缓冲液 微波炉加热融解 待冷却至待冷却至6565 左右加入左右加入2ul EB2ul EB 将凝胶液缓慢倒入胶槽 将凝胶液缓慢倒入胶槽 室温下静置 室温下静置30 min30 min 待凝固完全后 轻轻拔出梳子 待凝固完全后 轻轻拔出梳子 将胶板放在电泳槽中使用 将胶板放在电泳槽中使用 3 3 加样 用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样 加样 用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样 品小槽内 品小槽内 4 4 电泳电泳 120V120V电泳 当指示剂前沿移动至距离胶板电泳 当指示剂前沿移动至距离胶板1 2cm 1 2cm 处处 停止电泳 停止电泳 5 5 观察观察 紫外等下观察琼脂糖凝胶中的紫外等下观察琼脂糖凝胶中的DNA DNA 条带 条带 实验十 DNA片断的回收 纯化及连接 一 实验原理 目的片段的回收与连接 载体及目的DNA片断经酶切后 必须电泳分离后回收目 的片断 回收的方法 传统的方法 基于降低凝胶的熔点以释放DNA 然后通过 酚 氯仿抽提后乙醇沉淀回收 商品化的试剂盒 采用凝胶裂解液 如含有降低熔点的 NaI 融化凝胶释放DNA后 采用特殊的硅胶树脂吸附DNA 后 用洗液洗去杂质 最后用洗脱液洗出DNA DNADNA片段之间的连接片段之间的连接 主要是在主要是在DNADNA连接酶的作用下 使连接酶的作用下 使DNADNA裂口上核裂口上核 苷酸裸露的苷酸裸露的3 3 羟基和羟基和 5 5 磷酸之间形成共价结合磷酸之间形成共价结合 的磷酸二酯键 使原来断开的的磷酸二酯键 使原来断开的DNADNA裂口连接起来裂口连接起来 需需ATPATP 连接酶 把基因连在一起连接酶 把基因连在一起 二 仪器和试剂 1 1 仪器 仪器 离心机离心机 水浴锅 水浴锅 电泳仪电泳仪 2 2 材料 待回收材料 待回收DNADNA样品样品 3 3 试剂 试剂 1 DNA1 DNA回收试剂盒回收试剂盒 2 2 T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶 3 3 10X T4 DNA ligase buffer10X T4 DNA ligase buffer Tris HClTris HCl pH 7 6pH 7 6 MgCl2MgCl2 DTTDTT ATPATP 三 操作步骤 1 DNA酶切条带回收 北京艾德莱生物胶回收试剂盒 1 1 用干净无菌的刀片在用干净无菌的刀片在 365 nm365 nm紫外光下切割目的紫外光下切割目的 DNA DNA 条带 放入条带 放入1 5mL Ep1 5mL Ep管中 积累凝胶至大约管中 积累凝胶至大约300ul300ul 2 2 将目标片段切下的胶转移到预先称重的将目标片段切下的胶转移到预先称重的1 5ml eppendorf 1 5ml eppendorf 管中 称取凝胶重量 按照管中 称取凝胶重量 按照0 1g 100ul0 1g 100ul估算凝胶体积 估算凝胶体积 3 3 加入加入3 3倍体积的溶胶液倍体积的溶胶液DDDD 4 56 4 56 水浴水浴 10min 10min或直到凝胶完全溶解 每隔或直到凝胶完全溶解 每隔2 min2 min摇荡一摇荡一 次 次 5 5 取回收试剂盒中取回收试剂盒中吸附柱吸附柱E EC C装在装在2ml2ml收集管收集管上 将上一步所得上 将上一步所得 溶液加入吸附柱溶液加入吸附柱ECEC中 室温放置中 室温放置1min 1min 12000rpm12000rpm离心离心1min 1min 弃弃 去去收集管中平衡液 将柱子套回 收集管中平衡液 将柱子套回 6 6 加入 加入700ul 700ul 漂洗液漂洗液WB WB 乙醇已溶解乙醇已溶解 12000rpm12000rpm离心离心1min 1min 弃去弃去废液 废液 7 7 加入 加入500ul 500ul 漂洗液漂洗液WB WB 乙醇已溶解乙醇已溶解 12000rpm12000rpm离心离心1min1min 弃弃 去去废液 废液 8 8 将 将吸附柱吸附柱E EC C装回装回收集管收集管上 上 12000rpm12000rpm离心离心2min 2min 甩干柱子中甩干柱子中 残液 残液 9 9 将吸附柱 将吸附柱转移转移到到1 1个干净的个干净的1 5ml eppendorf 1 5ml eppendorf 管管中 加入中 加入 50ul 50ul 洗脱缓冲液洗脱缓冲液EBEB至柱子底部膜中央 室温放置至柱子底部膜中央 室温放置2min 2min 12000rpm12000rpm离心离心1min1min 收集离心液收集离心液为洗脱的为洗脱的DNA DNA 2 片断与载体连接反应 1 连接反应液的制备 加入 含有质粒载体的DNA溶液 2 l 插入片段DNA溶液 5 l 10X T4 DNA ligase buffer 1 l T4 DNA连接酶 0 5 l 灭菌的双蒸水 1 5 l 总体积为10 l 涡旋后混合均匀 涡旋至无气泡 2 16 反应过夜 注意 1 DNA纯化回收后 电泳检测应为单一的条带 如果切 胶过程中不慎带上杂带 那么回收后电泳结果可能会 出现两条以上的带 这时可以进行重复纯化回收 2 当连接反应难以进行时 可以适当延长反应时间 当连接效率仍然无所改变时 应当对DNA进行精制后 再反应 3 连接反应液可以直接用于转化 另外 当转化 DNA 量较大或者利用电刺激转化时 先用乙醇沉淀法精制 DNA 问 题 思 考 1 写出两种内切酶消化产物的末端序列 2 酶切片断的回收与连接时有哪些注意事项 3 克隆载体与表达载体的区别 。