本科毕业论文：一株产红色素真菌的初步鉴定及色素提取与稳定.docx

本科毕业论文：一株产红色素真菌的初步鉴定及色素提取与稳定本科毕业论文：一株产红色素真菌的初步鉴定及色素提取与稳定 目录摘要 Abstract2引言3菌株的鉴定5.1材料、试剂与仪器5.2方法6.3结果与分析6.4小结与讨论７2色素提取工艺的研究７2.1材料、试剂与仪器７2.2方法８2.3结果与分析02.4小结与讨论33色素稳定性的研究33.1材料、试剂与仪器33.2方法43.3结果与分析53.4小结与讨论20结语20参考文献21致谢24附录25摘要真菌色素是一种极具应用潜力的食用色素本文针对一株产红色素的真菌 A11625m，对菌株进行了鉴定、色素提取工艺和色素稳定性方面的研究实验结果表明：该菌株通过形态学鉴定为酒红拟青霉菌株所产红色素，其最大吸收波长为 510nm；色素提取时，以鲜菌丝直接浸提，最佳提取剂为丙酮，提取时间为 240min，提取温度为 30℃；提取时对菌丝进行超声波破碎预处理有助于色素的提取该色素在中性和弱酸弱碱条件下的稳定性较好；温度对色素稳定性的影响较小；糖类对色素稳定性的影响不明显；金属离子 mg2+、cu2+、Na+、k+、Fe3+、Zn2+、Fe2+、ca2+对色素稳定性的影响较小；过氧化氢对色素稳定性的影响较大，亚硫酸钠对色素稳定性的影响较小，抗坏血酸能提高色素的稳定性。

关键词：真菌；红色素；鉴定；提取；稳定性 Abstract Fungalpigmentswerepotentialresourcefornaturalfoodcolorant.Inthisarticle,anunknownfungusstrainA11625m,whichcanproduceredpigment, wasstudiedonitsidentification,pigmentextractionandthepigmentstability.ThisfungalstrainwasidentifiedasPaecilomycesvinaceusbymorphologicalcharacters.Themaximumabsorptionlightspectrumlenghofthepigment,whichproducedbythestrain,was510nm.Freshmyceliumwasmoresuitableforpigmentextractionthandrymycelium,thebestextractionsolventwasacetone,andtheoptimalextractiontimewas240minutes,theoptimalextractiontemperaturewas30℃.Inaddition,crushingthemyceliumcouldbehelpfulforpigmentextractionbyultrasonic.Thepigmentwasstableinneutral,weakacidicandalkalescentcondition.Temperaturehadthelittleeffectonthestabilityofthepigment.carbohydratehadnoinfluenceonthepigment.metallicions,suchasmg2+,cu2+,Na+,k+,Fe3+,Zn2+,Fe2+,ca2+hadthelittleinfluenceonthepigment;H2o2influencedthepigmentsignificantly;TheNa2So3hadlittleinfluenceonthepigment;Theascorbicacidcouldimprovethestabilityofthepigment.keywords:Redpigment;fungus;identification;extraction;stability引言 （1）天然色素概况色素也叫着色剂，是改变物品反射或者透射光颜色的物质。

根据不同的用途可分为染料、颜料、食用色素[1]食用色素是一类用于食品着色、改变食品色泽的食品添加剂，分为天然色素和合成色素两大类[2]合成色素是指人工化学合成得到的有机色素，具有色彩鲜艳、着色力强、性质稳定、价格便宜、可大规模生产等特点但是合成色素大多数属于煤焦色素或苯胺色素，会引起人体中毒、致泻以及致癌作用因此，现在世界各国己严格的限制使用多种合成色素，美国由 1960年允许使用的35种，仅剩下 7种；我国也从以前的 24种减少到 8种，并指定由专门的生产厂家生产[3,4]天然色素一般是从动植物组织中提取和微生物发酵获得[5]与合成色素相比安全性相对较高，着色色调比较自然，毒副作用小，而且一些天然色素本身就具有一定的营养价值和药理作用[6]但是，天然色素的着色强度较弱，对光、热、pH 值及氧化的敏感性较高，在大多数情况下，其成本比合成色素的成本高，且有些天然色素有异味、异臭，并且生产受到植物种类、地理、区域及季节的影响，供应量不稳定[6]随着现代食品工业的发展，人们越来越关注食品添加剂的安全问题由于相当一部分合成色素对人类的健康产生一定的毒副作用，天然色素的开发与应用已成为必然趋势真菌色素作为天然色素的一类，安全性可靠，色泽自然，并兼有营养作用和保健作用而备受人们的青睐[7]。

2）真菌色素的发展现状真菌能够分泌化学稳定性高、化学结构及色调多样的色素生产天然色素的真菌主要包括大型真菌和丝状真菌，能合成和分泌各种醌类、酸类、酮类以及一些含氮化合物色素[5-10]真菌色素是微生物色素中研究和应用最多的一类色素，特别是一些丝状真菌，它是天然色素的一大[25]丝状真菌中已获得高产色素的类群有红曲霉、青霉、虫草和拟青霉中的一些种其中，以红曲霉的研究最为广泛，在我国和日本等东南亚地区有着悠久的应用历史，但其同时伴随产生毒素桔霉素另外一些不产毒素的青霉，如产紫青霉及附球菌等研究报道较多[11-14]对于拟青霉产色素方面的研究只有少数几个种younjeungcho 等[15,16]研究了营养条件和通气量对蝉拟青霉菌丝体和红色素产生的影响；AliAsaff 等[17]研究了金属离子对玫烟色棒束孢产色素的影响；PalanivelVelmurugan 等[18]研究了光对粉质棒束孢产色素的影响3）真菌红色素的概况自然界中微生物资源非常丰富，很多微生物在生长过程中能够生成不同颜色和结构的色素，其中以黑色素、红曲色素、类胡萝卜素和天然蓝色素等研究最为广泛[19,20]红色素是天然色素中的一类，天然红色素一般被分为胡萝卜素、花色苷、黄酮、醌、叶琳、多酚等几类，但有关真菌红色素的研究甚少[21,22]。

刘小娟等[22]通过对菌株的筛选，得到一株高产红色素真菌，进行菌种鉴定，确认菌株属于串珠镰刀菌；王丽娟等[23]从油菜根系土壤中分离得到一株产红色素真菌，通过鉴定，确认菌株属于绳状青霉；谭友莉等[24]研究了三角叶黄连内生真菌产物红色色素的稳定性；陈立立等[25]从银杏枝条分离出的内生真菌，能产生大量的红色素，经鉴定该菌属于产紫青霉；PalanivelVelmurugan等[26]研究了从五种丝状真菌中提取天然色素作为皮革染料，其中产红色素的真菌就有紫红曲霉4）选题目的和研究内容我国天然红色素主要于植物，但受到生长周期、地理位置、提取工艺等条件的限制，导致天然红色素的产量及质量不稳定而微生物的生长周期短，生长环境易于控制，提取工艺简单且产品质量能得到保证因此，采用微生物发酵生产天然色素将逐渐成为天然色素的主流本课题以一株产红色素的未知真菌作为研究菌，通过对菌株的鉴定、提取工艺、稳定性等三个方面的探索，旨在为红色素的进一步开发与利用提供参考1）通过对该菌株进行形态学鉴定和分子系统学方法分析，确定其归属2）提取工艺的研究，通过实验获得适用于该色素提取的工艺条件3）色素稳定性的研究，为其开发应用提供基础参考。

菌株的鉴定.1材料、试剂与仪器.1.1供试菌株真菌菌株 A11625m，贵州大学真菌资源研究所提供1.2主要仪器分析天平、显微镜、生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、电泳仪、制冰机、生物安全柜、高速离心机、振荡器、微量移液枪、电泳槽、基因扩增仪1.3试剂引物、Taq 酶、dNTPs 等购自上海生物工程公司；棉蓝、蔗糖、琼脂2方法在查氏培养基、PDA 固体培养基上 25℃培养 14d，观察记载菌落特征并用显微镜观察、通过肉眼观察菌落和显微镜观察，微观产孢结构进行形态鉴定挑取培养基上新鲜菌丝，用 DNA提取试剂盒提取其总 DNA采用通用引物 ITS4和ITS5进行 PcR扩增，扩增产物送上海鼎安生物科技有限公司进行测序，得到的序列于 NcBI中进行 BLAST比对分析，并下载相近序列，用 mEGA5.0软件通过 maximumParsimony法构建系统发育树3结果与分析.3.1菌株形态学鉴定查氏培养基上，25c，14d，菌落直径达 40mm左右，绒毛状，白色，表面可见红色素分泌到培养基周围，边缘整齐，圆形；背面酒红色至红褐色菌丝透明，光滑，1-3μm；分生孢子梗无或简单，瓶梗单生或 2-3个轮生，细柱状至棒状，6-12×1-2μm；分生孢子单生，透明至半透明，短椭圆形，2-4×1-2.5μm，呈长链（图 1.1） 。

菌株形态结构和菌落特征与文献报道的酒红拟青霉[27]描述基本一致，故该菌株从形态上鉴定为酒红拟青霉（P.Vinaceus) 图 1.1菌株菌落与产孢结构注：图中 a、b 为菌落的正面和背面，c 为产孢结构Fig.1.1coloniesandconidiogenousstructureofthestrainNote:aandbwerethesurfaceandreverseofcolonies,cwasconidiogenousstructure..3.2菌株分子学鉴定对该株菌株进行 DNA提取、PcR 扩增和测序，从 GenBank中进行 BLAST下载相似度大于 90%的部分种的 ITS序列以及一些拟青霉属的 ITS序列，用 mEGA5.0软件进行多序列对比排序，并用 mP法构建系统发育树（图 1.2） 从树图看出菌株 A11625m以 73%的支持率与青霉属的一些种聚成一支，但其又与拟青霉属中的一些种有一定的亲缘关系图 1.2菌株和相似属的一些种基于 rDNAIITS-5.8S-ITS2序列采用 mP法构建的系统发育树Fig.1.2PhylogenetictreebasedonanalysisofrDNAITS-5.8S-ITS2sequencesofbacterialstrainandsomerelatedspeciesbymP.4小结与讨论按现代分类学的观点，拟青霉是一类有丝分裂孢子真菌和无性型真菌的形式属[28]，由 Bainier于 1907年以宛氏拟青霉为模式种而建立。

此属相当数量的种都属于边缘种，与曲霉，青霉，帚霉以及粘霉属等属相近[28]所以拟青霉属中的一些种的分类地位还需进一步的明确该菌株在形态上，尤其是产孢结构特征为典型的拟青霉形态特征，故形态学鉴定为酒红拟青霉，但通过 ITS序列的分子系统学鉴定结果与青霉属一些种的亲缘关系更近因此该菌株的归属尚需进一步利用多基因组序列来明确2色素提取工艺的研究2.1材料、试剂与仪器2.1.1供试菌株真菌菌株 A11625m，贵州大学真菌资源研究所提供2.1.2主要仪器岛津 UV-2450紫外分光光度计、分析天平、水浴锅、生化培养箱、摇床、生物超净台2.1.3试剂蔗糖、丙酮、甲醇、无水乙醇、95%乙醇均为国产分析纯2.2方法将活化的菌种接种于 PDA液体培养基中，摇瓶培养 10d，再静置培养 20d，将液面菌丝取出，吸去表面水分，收集待用。