银杏叶提取物检测.doc

河北联合大学冀唐学院 第一章 引 言术语和定义：总黄酮醇苷：包括槲皮素(Quercetin)、山奈素 (Kaempferel)、异鼠李素(Isorhamnetin)的糖苷类银杏叶提取物(EGB)因其具有抗氧化，拮抗血小板活化因子，改善血液流变学特性等药理活动，因而引起了广大研究者的兴趣，不论是衡量提取工艺的优劣和控制EGB的质量，还是为后续药理药效的实验研究提供可靠数据，一种能稳定，可靠的定量分析其主要药效物质黄酮类化合物的方法是十分必要的国内主要以铝盐显色然后比色的方法或直接进行比色的方法测定黄酮含量，但因此法受酚类物质干扰比较大，准确性和专属性比较差，只能做定性或半定量分析样品经酸水解后，通过高效液相色谱法测定槲皮素，山奈素，异鼠李素3种苷元的含量，在乘以一定的因子换算成总黄酮醇苷的方法 ，因其准确，快速等优点一逐渐被广泛接受，也是国际上公认的分析银杏叶总黄酮含量的方法应用范围： 本方法采用高效液相色谱法测定银杏叶提取物中总黄酮醇苷的含量，本方法适用于银杏叶经加工制成的提取物[1]1.1银杏叶提取物简介[2][本品来源] 本品为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶提取物。

[植物性状] 落叶乔木，可高达40m树干直立，树皮灰白枝有长短两种，叶在短枝上簇生，在长枝上互生叶片扇形，长4-8cm，宽5-10cm，先端中间2浅裂，基部楔形，叶脉平行，叉形分歧；叶柄长2.5-7cm花期4-5月，果期7-10月9-10月间采收，晒干　　 [植物分布] 全国大部分地区有产，主产广西、四川、河南、山东、湖北、辽宁、江苏等地　　[产品性状] 银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E为浅黄棕色可流动性粉末，有本品固有的香气，味苦　[产品含量] 按干燥品计，银杏总黄酮含量≥24.0%1.2 银杏叶提取物的功效[3][药理作用] 银杏叶目前仍被中国医药用于治疗记忆丢失，胃部疼痛，痢疾，高血压、精神紧张和呼吸道问题如哮喘，支气管炎和循环不良及其引起的焦虑银杏的活性成分是萜烯部分，其中包括银杏内酯和白果内酯这些银杏黄酮－糖甙成分具有强大的抗氧化与自由基能力1.2.1 促进循环  银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.能同时促进大脑和身体肢体的循环银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.的一个主要保健功能就是抑制一种称为血小板活化因子（PAF）的物质，PAF是一种从细胞中释放的介质，其会导致血小板聚集（堆积在一起）。

高含量的PAF会导致神经细胞损伤，中枢神经系统血流量降低，发炎，和支气管收缩与自由基非常相似，高PAF水平也会导致衰老银杏内酯和白果内酯可在缺血（体内组织缺少氧气）时期内保护中枢神经系统的神经细胞不受损伤该功能可能能对苦于中风的患者有辅助治疗的作用除了抑制血小板粘着外，银杏提取物调节血管张力和弹力换句话说，其可令血管循环更加有效率该提升循环效率作用对循环系统中的大血管（动脉）和较小血管（毛细血管）都有同样作用 1.2.2 抗氧化作用  银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.可能在大脑，眼球视网膜和心血管系统中可发挥抗氧化特性其在大脑和中枢神经系统中的抗氧化作用可能有助于防止因年龄导致的大脑功能衰落银杏叶提取物在大脑中的抗氧化功能特别使人感兴趣大脑和中枢神经系统特别易受自由基攻击自由基导致大脑损伤被广泛认为是导致伴随衰老而来的多种疾病的影响因素，其中甚至包括阿兹海默症  1.2.3 抗衰老功能  银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.提升大脑血流量并对神经系统有极好的滋补作用包含上万患者的数百次科学研究证实了银杏叶提取物的功效对包括大脑血流不足和老年患者的智力衰退在内的诸多问题的效力。

银杏对许多衰老的可能症状都有很好的效果，例如： 焦虑和忧郁 、记忆损伤 、难以集中注意力，机敏度下降 、智力下降 、眩晕，头痛 ,耳鸣（耳中鸣响）、 视网膜黄斑部退化（成人失明的最普遍原因）、 内耳骚动（其会导致部分失聪）、 末端循环不良 、阴茎血流不良导致的阳痿  1.2.4 痴呆，阿兹海默症和记忆力提升  科学家回顾了所有已出版的对银杏和轻微记忆损伤的高质量研究，并得出结论：银杏在提升记忆力和感知功能方面较安慰剂明显更加有效 银杏在欧洲被广泛用于治疗痴呆银杏被认为可有助于防止或治疗这些脑部紊乱的原因是其可增加脑部血流量及其抗氧化功能尽管许多临床试验有科学上的缺陷，银杏可能增加阿兹海默症患者思考能力，学习能力和记忆力的证据仍被抱以很大期望 21.2.5月经前不快症状  一次评价银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.对有月经前不快症状妇女益处的双盲受控安慰剂研究，该试验包括143名年龄在18-45岁的妇女，并跟踪她们两个月经周期在第一个周期的第16天每个妇女都收到银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.（每天两次，每次80mg）或安慰剂，治疗持续至下一周期的第5天，并在该周期的第16天重新开始。

结果令人印象深刻和安慰剂比较，银杏明显地减轻月经前不快症状的主要征候，特别是乳房疼痛和情绪不稳  1.2.6 性功能不良  尽管目前没有关于此功能的双盲试验根据，但病例报告和开放研究提出银杏能使因扑洛扎克类药物及其它抗抑郁药物而来的性功能不良好转1.2.7 眼部问题  银杏中的类黄酮也许能停止或缓解某些视网膜病变视网膜受损有许多可能原因，包括糖尿病和视黄斑病变视黄斑病变（一般称为老年黄斑病变或ARMD）是渐进的退化性眼部疾病，并易发生于老年人身上其是美国导致失明的主要原因研究提出银杏也许有助于保持ARMD患者的视力  剂量： 主流意见认为用于治疗包括眩晕、耳鸣和间歇性跛行在内的末端微循环问题时，每天120-160ml的剂量十分适合治疗痴呆症，轻微忧郁和提升认知能力，可使用更高的剂量（大约240mg/天）为取得最佳效果，每日服用量一般被分为2-3次服用确认使用提取物的标准为含有至少24％的银杏黄酮糖苷和6％的萜烯内酯－因为这是提取物在每次临床试验中提取物显示实质功效的等第二章 实验材料2.1 实验仪器和试剂及试药：仪器：安捷伦化学工作站；超声波清洗仪（功率250W，频率20KHz）；电子天平（感量为十万分之一）；十八烷基硅烷键合硅胶柱试剂：甲醇（色谱纯 ）；水（二次蒸馏水）； 0.4％磷酸水溶液：取4.00ml磷酸（分析纯）加水稀释成1000ml，摇匀即得； 25%盐酸：取69.4ml盐酸加水稀释成100ml，摇匀即得试药：槲皮素对照品（含量测定用，批号：100081-200406，97.3% 中国药品生物制品检定所提供）；山奈素对照品（批号：110861-200808，95.9% 中国药品生物制品检定所提供）；异鼠李对照品（批号：110860-200608，置五氧化二磷减压干燥12小时后使用，中国药品生物制品检定所提供）2.2色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50）为流动相；检测波长为360nm。

理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500[4] 第三章 实验操作3.1 方法原理： 方法原理： 本品加甲醇-25%盐酸溶液（4：1）加热回流，冷却，用甲醇稀释，摇匀，滤过，续滤液进入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于波长360nm处检测槲皮素的吸收值，计算出其含量3.2 对照品制备：分别精密称取槲皮素对照品、山奈素对照品、异鼠李素对照品，加甲醇制成每1mL分别含30ug、30ug、20ug的混合溶液；或精密称取已标示槲皮素、山奈素、异鼠李素含量的银杏叶对照提取物35mg，照供试品溶液的制备方法，同法制成对照提取物溶液[5]3.3 供试品制备：取本品约35mg，精密称定，加甲醇-25%盐酸溶液（4：1）的混合溶液25mL，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温，转移至50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，续滤液作为供试品溶液[5]3.4 测定法：分别精密吸取对照品溶液（或对照提取物溶液）和供试品溶液各10uL，注入高效液相色谱仪，用紫外吸收检测器于波长360nm处测定槲皮素、山奈素和异鼠李素的峰面积，计算出其含量[5] 总黄酮醇苷=（槲皮素+山奈素+异鼠李素）×2.51 （本品按干燥品计算含黄酮醇苷不得少于24.0%）3.4.1 仪器精密度试验精密吸取提取物对照品溶液10μl，按上述色谱条件重复进样4次，测定槲皮素、山奈素、异鼠李素的峰面积，结果见下表。

表3-1精密度试验（槲皮素峰面积）序号1234平均值RSD(%)峰面积2672.92652.82672.82682.22670.10.47 表3-1 精密度试验（山奈素峰面积）序号1234平均值RSD(%)峰面积2646.72655.52693.62690.62671.60.89 表3-3 精密度试验（异鼠李素峰面积）序号1234平均值RSD(%)峰面积1391.51390.51414.91425.41405.51.24结果对照品的槲皮素峰面积的RSD=0.56%，小于2.0%，山奈素峰面积的RSD= 0.89%小于2.0%，异鼠李素峰面积RSD= 1.24%小于2.0%，说明仪器精密度良好3.4.2 供试品溶液的稳定性试验取银杏叶提取物（批号：N111212,厂家：徐州恒凯银杏制品有限公司），按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别在0h、2h、4h、6h、依法测定槲皮素、山奈素、异鼠李素峰面积，结果见下表 表 3-4 稳定性试验（槲皮素峰面积）序号1234平均值RSD(%)峰面积3318.63319.13316.83326.73320.30.14 6表3-5 稳定性试验（山奈素峰面积）序号1234平均值RSD(%)峰面积3065.33069.13045.93109.63072.40.88 表3-6 稳定性试验（异鼠李素峰面积）序号1234平均值RSD(%)峰面积689.8688.7685.9691.2688.90.33结果槲皮素峰面积的RSD=0.14%，小于2.0%，山奈素峰面积的RSD=0.88%，小于2.0% ，异鼠李素峰面积的RSD=0.33%，小于2.0%，说明供试品溶液在6小时内稳定。

3.4.3 重复性试验取同一批次样品（批号：N111212）4份，按供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，按上述色谱条件测定，结果见下表 表3-7 重复性测定结果序号1234平均值RSD(%)取样量mg35.9135.1431.8632.4926.31.22槲峰面积3318.83326.62839.02852.1浓度（槲）1.8121.8。