基于SmartChipHT-qPCR分析不同食品中抗生素抗性基因的多样性及丰度.docx

    基于SmartChipHT-qPCR分析不同食品中抗生素抗性基因的多样性及丰度    陈亚波，谭贵良，胡燕玲，金倩仪，朱爽，孟嫚，邱雨薇，李雪雁（1.中山市食品药品检验所，广东中山 528437）（2.电子科技大学中山学院，广东中山 528402）（3.广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州 510006）（4.广东利诚检测技术有限公司，广东中山 528436）抗生素是指由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物或人工合成的类似物抗生素对微生物的生长和代谢活动有较强的抑制作用，其在低浓度下就可在一定程度上抑制甚至杀死其他微生物[1]据不完全统计，2020年我国农用抗生素产量达到23.14万t，预计2022年我国农用抗生素产量达23.86万t然而抗生素的过量或长期低剂量的使用会使微生物产生耐药性[2]，导致抗生素抗性基因（Antibiotics Resistance Genes，ARGs）的产生和传播[3]ARGs被认定为21世纪新型污染物[4]，它广泛存在于人类、动物体内以及复杂的环境中ARGs可通过各种可移动遗传元件（Mobile Genetic Elements，MGEs）如整合子、转座子或质粒等，通过水平基因转移（Horizontal Gene Transfer，HGT）的方式，转移到其它环境细菌和致病菌中[5]，对人类健康和生态环境造成潜在威胁。

目前针对ARGs的大多数研究主要集中在土壤、饮用水、医院和生活污水等环境领域[6-8]，对于食品领域中ARGs的研究报道相对较少在食品领域，已有的研究大都基于普通PCR或传统荧光定量PCR（q-PCR）检测食品中的ARGss研究发现，在虾、鱼和贝类等水产品中可检出磺胺类、四环素类、氨基糖苷类ARGs（如tetA、tetB、tetM、sul Ⅱ、floR、aphA-1、aadA、ermB、cmlA）[9]；在发酵乳制品中可检出tetO、ermB、cat等22种常见ARGs[10]；在肉类、水产品、蔬菜和水果中可检出11个ARGs[11]；在畜禽养殖场周边蔬菜地生食蔬菜可检出磺胺类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、喹诺酮类4类ARGs[12]最近，也有报道采用宏基因组测序方法研究了商品腐乳[13]、辣椒酱[14]以及牛奶和牛奶生产环境[15]中ARGs的分布和丰度与前者不同，后者宏基因组测序方法属于高通量方法，不需要专门针对具体ARGs的种类设计引物，可检测出超过150种ARGs[15]对更多的食品及环境中多种ARGs的检测分析，是当前以及今后一个重要的研究方向SmartChip定量PCR系统是美国WaferGen Biosystems公司推出的一款高密度、纳升级别的高通量实时定量PCR系统（High-Throughput qPCR，HT-qPCR）[16]。

一张SmartChip包含5 184个微孔，一次运行可同时完成多达5 184个独立的扩增反应该系统广泛应用于基因表达定量、基因分型等研究领域特别是近年来SmartChip定量PCR系统在环境领域中ARGs的研究备受关注，研究涉及土壤[17]、猪粪施肥下的水稻和小麦叶片[16]，土壤及蔬菜[18]，最近也开始陆续应用于即食沙拉[19]、海鲈[20]等食品安全领域研究但是对于采用HT-qPCR同时分析不同类型食品中ARGs的研究至今未见报道考虑到ARGs对人体健康的潜在风险，更全面的评估不同食品中的ARGs多样性及丰度显得尤为必要因此，本研究针现有研究不足，采用SmartChip HT-qPCR方法，使用296对引物对水产品、发酵食品、肉类、蔬菜的285个ARGs和10个MGEs标记基因进行定量分析，旨在探究这些食品中ARGs和MGEs的分布特征，为潜在的食品安全风险分析提供理论支持1 材料与方法1.1 实验样品分为水产品、发酵食品、肉类、蔬菜四大类，共15个样品其中水产品样品2个（海鲈，AP-SB-2；草鱼，AP-WA-2）、发酵食品2个（黄豆酱，F-HDJ7；发酵火腿，F-HT1）、肉类3个（牛肉，M-BE-2；鸽子肉，M-DO-2；猪肉，M-PO-2）、蔬菜8个（大白菜，V-CA-3；香菜，V-CI-3；生菜，V-CL-2；生菜，V-CL-3；枸杞叶，V-CWL-3；莴苣，V-LE-2；番茄，V-TO-2；白萝卜，V-TU-2）。

上述样品取自中山市的菜市场、海鲜市场和超市，于2 h内运送至实验室1.2 主要仪器与设备SmartChip Real-time PCR系统，美国WaferGen Biosystems；Milli-Q Integral 3 System纯水系统，美国Millipore公司；高速冷冻离心机，德国Sigma公司；均质器，西班牙IUL公司，组织匀浆仪，美国MP公司；Qubit 2.0荧光计，美国Invitrogen公司1.3 样品前处理处理样品前，将所有器具包括砧板、解剖刀、剪刀、镊子、研钵等进行灭菌处理；样品解剖过程带无菌乳胶手套1）鱼样：取解冻后的鱼清洗表面，用解剖刀分离出肉及内脏取约25 g肉或内脏放入带侧滤的一次性无菌均质袋中称重，加入10倍体积0.1%（m/V）蛋白胨水，放入拍打式均质器中拍打2 min～3 min；用无菌移液管吸出滤液，于-80 ℃保存以备下一步提取DNA2）畜禽肉：取解冻后的样品，清洗表面，取约25 g肉或内脏放入带侧滤的一次性无菌均质袋中称重，加入10倍体积0.1%（m/V）蛋白胨水，放入拍打仪拍打2 min～3 min；用无菌移液管吸出滤液，于-80 ℃保存以备下一步提取DNA。

3）蔬菜：方法1：用研钵研磨或用剪刀剪碎样品，取约25 g左右样品放入带侧滤的一次性无菌均质袋中称重，加入10倍体积0.1%（m/V）蛋白胨水放入拍打仪拍打2 min～3 min；用无菌移液管吸出滤液，于-80 ℃保存以备下一步提取DNA方法2：取蔬菜日常可食用部分，经无菌水清洗后，称量按叶菜类1:4、根茎类1:1的比例加入0.1%（m/V）蛋白胨水，浸泡30 min后超声5 min，将上清用0.22 µm滤膜抽滤，用无菌剪刀剪碎滤膜以备下一步提取DNA4）发酵食品：直接取0.5 g样品，进行下一步DNA提取1.4 总DNA的提取采用EZNA™ Mag-Bind Food DNA kit （Omega Bio-Tek, Inc., Norcross, GA，美国）提取样品中的总DNA，每个样3个重复DNA浓度和质量采用Qubit 2.0进行测定和评估，提取的DNA保存于-20 ℃，以备后续分析1.5 ARGs和MGEs的高通量测定抗生素抗性基因检测使用SmartChip高通量荧光定量PCR系统完成，该系统每次能够并行5 184个纳升级qPCR反应本次实验中共设置296对引物，其中285对抗性基因引物、10对可转移基因引物对（包括2对Ⅰ类整合酶基因、8对转座酶基因）、1对细菌通用16S rRNA基因内参引物。

高通量荧光定量PCR扩增体系的体积为100 nL，其反应体系为：1×LightCycler 480 SYBR Green IMaster、500 nmol/L each primer、DNA模板2 ng/μLPCR反应混合液先使用纳升级多样品点样仪（MSND）的16（Samples）×296（Assays）模式加入到微孔芯片中，随后在cycler上进行qPCR反应，共运行3张芯片PCR反应程序为：预变性95 ℃，10 min；接着95 ℃变性30 s、60 ℃退化30 s，共40个循环使用仪器的qPCR软件对qPCR结果进行自动分析检测阈值Ct=31，每个样品进行3次技术重复，至少2次技术重复都扩增出来则被认为目的基因在该样品中有检出做相对定量时，作图数据采用Relative copy number=Copy(gene)/Copy(16S)，其中Copy(gene)和Copy(16S)均来自同一样品其中，Copy=10(31-CT)/(10/3)将Relative copy number×106，然后取以10为底的对数值，进行热图绘制采用利用R package pheatmap（版本1.0.8）绘制聚类热图。

1.6 数据分析采用Excel 2019进行数据整理，采用GraphPad Prism 8进行柱状图作图2 结果与讨论2.1 ARGs和MGEs的多样性在所有检测的样品中，共检测到9个大类的抗生素抗性基因（图1），分别是氨基糖苷类（Aminoglycoside）、β-内酰胺类（Beta-Lactamase）、氯霉素类（Chloramphenicol）、大环内酯-林可霉素-链阳霉素类（Macrolide-Lincosamide-Streptogramin B，MLSB）、多重耐药类（Multidrug），磺胺类（Sulfonamide）、四环素类（Tetracycline）、万古霉素（Vancomycin）以及其他类其中，样品F-HDJ7（黄豆酱）、V-CA-3（大白菜）、V-CI-3（香菜）、V-CL-3（生菜）和V-CWL-3（枸杞叶）检出的ARGs较多，分别检测出ARGs 161个、136个、165个、128个和182个这些样品中检测到的ARGs数量与前人在即食沙拉样品到的大致相同（156个）[19]上述15个样品共检出ARGs亚类（指具体的ARG）234个（氨基糖苷类33个，β-内酰胺类45个，氯霉素类3个，多重耐药类45个，MLSB 33个，磺胺类6个，四环素类36个，万古霉素类21个、其他类12个以及移动基因元件10个（IS613、Tp614、cIntI-1(class1)、intI-1(clinic)、tnpA-01、tnpA-02、tnpA-03、tnpA-04、tnpA-05、tnpA-07）（表1）。

表1 样品中的MGEs分布Table 1 The diversity of MGEs图1 不同样品中ARGs的数量及多样性Fig.1 Numbers and diversity of ARGs detected in various samples细菌可以通过可移动遗传元件（MGEs）如整合子、转座子、质粒的水平基因转移而获得ARGs[5]，从而使得该菌获得抗生素抗性MGEs是部分ARGs的携带载体，在ARGs的水平转移中起着非常重要的作用，其转移不但可以发生在同一种属细菌甚至还发生在细菌和真菌之间[21]对MGEs的分布研究发现（表1），所有样品均可检出整合酶和转座酶基因具体而言，所有样均能检测整合子基因intI-1(clinic)；除了M-DO-2和V-CA-3外，其余样品均能检出转座酶基因tnpA-01和Tp614，所分析的8个转座酶基因均能在2个蔬菜样品（V-CI-3和V-CWL-3）被检出intI-1属于Ⅰ类整合子，在前人对水产品[9]和零售食品[22]的研究中也均有发现研究发现，超过80%的人体或畜禽体内的肠细菌（Enterobacteria）中存在该整合子[23]整合子是一种重要的基因捕获和传播元件，能够通过整合酶从外界环境中捕获和堆积一个或多个ARGs，在微生物的耐药性中具有重要作用，是耐药基因水平传播的重要机制。

在所有样品中均检测到Ⅰ类整合子，说明抗生素的使用增加了这类基因尤其intI-1（clinic）的丰度，这些MGEs介导的细菌耐药性传播而引起的食源性疾病应引起重视2.2 ARGs抵抗机制分析ARGs抵抗机制见图2检测到ARGs抵抗机制包括：抗生素灭活机制（Antibiotic Deactivate）、细胞保护机制（Cellular Protection）、外排泵机制（Efflux Pump）、Integ。