多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞生物学特性分析【医学论文】.doc

医学论文-多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞生物学特性分析作者：朱步东 任军 王湘漪 李昕 聂鋆【摘要】 　　为了研究多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）病人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）的病理生物学特性，以探讨 MSC在 MM 骨损伤发生中的作用，取 11 例初治 MM 病人和 5 例正常人骨髓，用贴壁法体外分离培养 MSC 应用流式细胞术分析 MM 骨髓 MSC 表型，MTT 法检测 MSC 增殖能力，组织化学染色测定细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化能力应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测定细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor, SCF）浓度收集 MSC 培养上清作为条件培养液，按梯度浓度加入人SKO007 骨髓瘤细胞系培养体系中，MTT 法测定细胞增殖能力差异结果表明：与正常人骨髓 MSC 比较，MM 患者骨髓 MSC 的表型无改变，均一表达CD29、CD73、CD166 和 HLA-ABC，不表达 CD45 和 CD31； MM 患者骨髓 MSC 增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能； MM 骨髓 MSC 分泌 IL-6 和 SCF 的水平均明显高于正常； MM 来源的 MSC 培养上清显着促进 SKO007 细胞的增殖。

结论： MM 患者骨髓 MSC 的增殖分化功能正常，MM 时骨损伤可能与MSC 分化功能无关，而 IL-6 和 SCF 高表达为骨髓瘤细胞提供了必要的生存信号关键词】 间充质干细胞; 多发性骨髓瘤; 细胞因子Biological Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow of Patients with Multiple MyelomaAbstractThe study was purposed to explore the role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the pathogenesis of bone disease particularly observed in multiple myeloma (MM), the biological features of marrow derived MSCs from patients with MM have been investigated. Marrow aspirates were harvested from 11 newly diagnosed patients with MM and 5 normal adults and MSCs were isolated and culture-expanded by the cell properties of adherence to plastic flasks, The phenotype was analyzed by flow cytometric technique. The proliferation of MSCs was observed by MTT assay and their differentiation capacities into osteoblasts and adipoblasts were assessed with lineage-specific histochemical staining. The concentrations of IL-6 and SCF in the culture supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). MSC culture supernatants were collected and MTT assay was performed to evaluate their support on the proliferation of an MM cell line SKO007 cells. The results showed that bone marrow-derived MSCs from MM patients were homogenously positive for CD29, CD73, CD166 and HLA-ABC and negative for hematopoietic cell marker CD45 and endothelial cell marker CD31, the phenotype of which was similar to that of marrow counterparts from normal adults. MTT assay indicated that MSCs from MM patients or normal adults proliferated at similar rates. MSCs from MM patients occupied in vitro osteogenic and adipogenic capacity as those from normal adults. The levels of IL-6 and SCF in culture supernatant were greatly up-regulated in MM patients by ELISA assay. Furthermore, MSC culture supernatants from MM bone marrow displayed enhanced activity to promote the proliferation of SKO007 cells. It is concluded that marrow-derived MSCs from bone marrow of MM patients are normal in their proliferation and differentiation capacities, and myeloma bone disease may not be ascribed to the differentiation of MSCs while the elevated secretion of IL-6 and SCF may provide necessary cues for the survival of malignant myeloma cells.Key wordsmesenchymal stem cell; multiple myeloma; cytokine多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）患者呈现特征性的骨质破坏。

这种骨质损伤与破骨细胞数量增加，成骨细胞数减少，从而导致骨吸收与成骨之间失平衡有关［1］间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是存在于骨髓的结缔组织干细胞，不但可以向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化，而且是骨髓基质细胞的前体细胞［2］骨髓基质细胞为骨髓瘤细胞提供了必需的生存和增殖支持，并由此促进破骨细胞的增殖分化，导致溶骨性损伤［3］；而骨髓瘤细胞可通过细胞因子分泌和(或)细胞间的直接接触，引起成骨细胞的凋亡［4］但是，以上这些病理改变是否涉及 MSC 本身，抑或 MSC 的某些改变促进了疾病进程尚不清楚为此，我们对骨髓瘤 MSC 的特性进行了研究材料和方法　　材料来源11 例 MM 均为初治患者，男 7 例，女 4 例，平均年龄 59.4 岁; IgG 型 6 例，IgA 型 3 例， κ 轻链型 2 例对照骨髓来源于骨髓象和血象检查正常的健康人，共 5 例，其中男 3 例，女 2 例，平均年龄 51.7 岁SKO007 MM 细胞株为本研究所传代的细胞株骨髓 MSC 的分离和培养按参考文献［2］的方法，取肝素抗凝的骨髓，α-MEM 稀释 2 倍后 Percoll梯度密度离心收获单个核细胞。

将细胞接种于含 10%人骨髓 MSC 专用培养血清的 α-MEM 中（血清为 Stem Cells 公司产品），培养 48 小时后去除非贴壁细胞，继续培养至贴壁细胞约 80%融合，收集培养上清于-70℃冻存备用0.05%胰蛋白酶消化传代培养第 3 代细胞用于以下实验细胞免疫表型分析胰蛋白酶消化收集 MSC，加入 FITC 或 PE 标志的小鼠源抗人CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD166、HLA-ABC 和 HLA-DR 单克隆抗体（eBioscience 公司产品），室温下避光反应 30 分钟用 PBS 洗涤 2 次后，FACSCalibur (Becton Dickinson， USA)收集细胞参数，用流式细胞仪检测，WinMDI 2.9 软件分析结果增殖能力的 MTT 法测定收集 MSC，按 750 个细胞/孔接种于含 MSC 完全培养液的 96 孔培养板中，每组 6 孔；将 SKO007 细胞按 1000/孔接种于不含血清的 RPMI 1640 培养液的96 孔培养板中，培养体系中分别加入 10%、20%和 40%的 MSC 培养上清，每组 4孔细胞培养 72 小时后加入 10 μl MTT（1 g/L），继续培养 4 小时。

离心去除培养液，加入二甲亚砜裂解细胞，以未加 MTT 孔为本底，570 nm 波长下测定 OD 值多系分化的鉴定成骨分化将细胞按 5×104/孔接种于 6 孔培养板，或 1×104/孔接种于 24孔培养板中，加入地塞米松（10-7mol/L）、维生素 C（50 mg/L）和 β-磷酸甘油（10 μmol/L），培养 12 天，期间换液 2 次应用白细胞 ALP 染色试剂（Sigma 公司产品）进行碱性磷酸酶原位染色成脂肪分化将细胞按 2×104/孔接种于 24 孔培养板中，次日加入地塞米松（10-6mol/L）、IBMX（0.5 mmol/L）和消炎痛（10 μmol/L），连续培养 7 天后去除培养基，用 PBS 洗涤 2 次后多聚甲醛室温固定 1 小时，1%油红 O 染色，光学显微镜下观察MSC 的细胞因子分泌功能测定消化传代细胞培养至贴壁层致密时，更换无血清的 α-MEM，培养 48 小时后收集培养上清，于-70℃冻存备用按照试剂盒（Bio-Rad 产品）操作说明，应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测定，依据由重组人白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor, SCF）（Peprotech 产品）所作的标准曲线，测定培养上清 IL-6和 SCF 浓度。

统计学处理试验数据以平均值±标准差（±SD）表示，以 t 检验进行数据分析，P 值0.10) ，MM患者骨髓 MSC 增殖能力正常（图 2）MM 患者与正常人骨髓 MSC 体外成骨和成脂肪能力比较MM 患者和正常人骨髓 MSC 经成骨诱导体系培养后，细胞形态均发生了明显的变化，部分细胞由纺锤形转变为多边形或不规则形状；12 天后经 NBT-BCIP染色显示细胞碱性磷酸酶（ALP）活性，MM 患者骨髓与正常人骨髓组细胞显色强度比较无明显差别（图 3A、B），显示 MM 患者骨髓 MSC 成骨能力并没有减低应用成脂肪诱导体系作用 7 天，油红 O 染色显示两组细胞体外成脂肪性能未见明显差别，MM 患者骨髓 MSC 体外成骨和成脂。