（新编）译文—血糖调节肝FXR受体的表达.doc

血糖调节肝 FXR 受体的表达高甘油三酯血症和胆囊疾病在糖尿病或胰岛素抵抗患者的发生呈普遍增加的趋势高甘油三酯血症同胆囊疾病风险呈正相关类法尼醇 X 受体（FXR）是胆汁酸激活的核受体在胆汁酸和甘油三酯稳态中发挥重要作用对控制 FXR 基因表达的机制知之甚少这项研究评估是否通过血糖稳态的改变调节 FXR 基因的表达FXR 表达在链霉素诱导的糖尿病鼠肝脏中减少，在胰岛素补充后其表达上升至正常随着糖尿病的进展，FXR 的表达在中老年糖尿病 Zucker 鼠中也减少在原代大鼠肝细胞中，D-葡萄糖以剂量和时间依赖的方式增加了 FXRmRNA，然而胰岛素却有着不同的反应除了木酮糖-5-磷酸盐的前体木糖醇，作为 D-葡萄糖增加原发性大鼠肝细胞 FXR 的表达最终，FXR 靶基因（SHP 和载脂蛋白 C-III）的表达是通过 D-葡萄糖和 FXR 配体双重调节的这项研究证明 FXR 在糖尿病动物模型中减少另外，FXR 通过葡萄糖经过磷酸戊糖途径调节的FXR 表达的调节失常或许能引起糖尿病或胰岛素抵抗患者糖脂代谢失常全球超过 3 亿人正处于患糖尿病的风险1 型糖尿病相对来说发生的比较早，是由于胰岛 β 细胞的破坏所致。

相反，2 型糖尿病在中年人中发病较多，是由于生活方式引起胰岛素抵抗的结果胰岛素抵抗最初以糖耐量受损为特征，随后以胰岛细胞受损最终发展为 2型糖尿病2 型糖尿病患者通常发生高甘油三脂血症，而这同发生胆囊疾病风险呈正相关，是糖尿病患者一个普遍存在的病理改变另外，胆汁组成的改变被描述在糖尿病患者中然而胆汁酸代谢和甘油三酯稳态在糖尿病或胰岛素抵抗中的分子联系仍有待于进一步研究血糖是基因表达的重要调节器最近研究已经识别出转录因子，例如上游刺激因子，固醇反应元件结合蛋白-1c，鸡卵白蛋白上游启动子转录因子 -2 和糖类反应元件结合蛋白，作为糖诱导基因调节的调节器然而，糖调节这些因子的转录活性的机制仍不十分清楚葡萄糖影响基因转录或许是由代谢分子如葡萄糖-6-磷酸盐（葡萄糖 -6-磷酸酶合成的底物）调节的，或者是木糖醇-5-磷酸盐，是磷酸戊糖途径的非氧化分支的中间代谢物除此之外，己糖胺旁路也通过葡萄糖参与了基因的调节类法尼醇 X 受体（FXR）是核受体超家族的一员，在肾上腺、肠道、肾脏和肝脏内表达FXR 与 FXR 反应元件（ FXREs）结合在异二聚体之后与类维生素 A 结合对于FXR/RXR 异二聚体最佳 DNA 结合序列是被核酸隔开的两个 AGGTCA 反向重复序列。

然而，FXR 作为一个单体也与延伸的半位点结合胆汁酸是天然的 FXR 配体，然而GW4064 是合成的非固醇类 FXR 激动剂FXR 通过减少固醇-7α- 羟化酶（Cyp7a1）的表达负反馈调节胆汁酸的合成，Cyp7a1 是胆汁酸合成的限速酶，在某种程度上通过间接机制参与小分子异源二聚体伴侣（SHP）的诱导另外，通过增加回肠胆汁酸结合蛋白的转录，抑制肝脏胆汁酸主动转运 Na-牛黄胆酸盐联合转运多肽的表达，诱导胆酸盐输出泵和多药抵抗相关蛋白，FXR 控制胆汁酸的肠肝循环总之，胆汁酸激活的 FXR 控制胆汁酸稳态FXR 也调节脂代谢缺乏 FXR 的老鼠显示血清胆固醇和甘油三酯水平升高而且，FXR 调节基因控制脂代谢，例如载脂蛋白 C-II,载脂蛋白 C-III, 载脂蛋白 A-I, 载脂蛋白 E和 磷脂转运蛋白另外，FXR 诱导过氧化物酶体增殖物激活受体 -α 的表达，其是另一个控制甘油三酯代谢的核受体，证实了 FXR 在甘油三酯代谢的潜在作用考虑到糖尿病患者高甘油三脂血症和胆汁酸代谢改变之间的临床联系以及 FXR 在甘油三酯和胆汁酸稳态中的关键作用，我们开始评价是否在改变血糖稳态的条件下调节 FXR 基因的表达。

我们的结果显示链脲霉素（STZ ）诱导的糖尿病呈现出下调 FXR 基因的表达除此之外，肝 FXR 表达减少 ZDF 鼠伴随的糖尿病的进展而且，通过使用非糖尿病鼠的原发性肝细胞，我们得出 D-葡萄糖确实以剂量依赖和时间依赖方式调节 FXR 基因的表达，可能是在转录水平发挥作用另外，FXR 靶基因 SHP 和载脂蛋白 C-III 的表达是通过血糖和 FXR 配体调节的最后，我们得出葡萄糖的作用是通过磷酸戊糖途径的代谢物调节的研究设计和方法从 IFFA CREDO 购买的雄性大白鼠封闭在温度控制在 12 小时白天/黑夜循环的环境下，可以免费获取食物和水从基因模型中获得的 5 周龄的雄性祖克尔糖尿病肥胖和消瘦的老鼠，维持在普瑞纳5008 饮食条件下一共 48 只老鼠分成三组，每组 16 只（8 只 ZDF 鼠和 8 只 ZLC 鼠） ，分别在 6 周、10 周、20 周龄体重和食物消耗通过实验进行检测血液样本是在麻醉状态下眼窝穿刺获得的，检测出血糖和胰岛素水平所有试验根据指南实验动物方针和使用的基础上进行的STZ 诱导的糖尿病 该协议使用 STZ 诱导的糖尿病鼠在前面已经描述通过单一腹膜内注射 STZ 诱导糖尿病（6 毫克/100 克体重，n=14） 。

对照组老鼠（ n=5）接受腹腔内注射溶剂（3%柠檬酸钠）的方法通过饮食过量、烦渴和多尿的发展认为是糖尿病，通过血葡萄糖的水平证实糖尿病三周后 STZ 注射糖尿病鼠的一组使用胰岛素治疗在注射 STZ 后第四周进行了实验在这四周的实验中没有一只接受 STZ 的老鼠死掉原代大鼠肝细胞 通过往大白鼠肝脏中输入胶原酶而使肝细胞分离在 37°C 温度 5%二氧化碳 95%空气的湿度下，在血清中加 2mmol/l 谷氨酸盐，25ug/ml 庆大霉素，100 nmol/l地塞米松和 0.1%游离脂肪酸，在这种条件肝细胞（通过台盼蓝清除试验测定细胞生存率＞85%）作为单层细胞进行培养4 小时潜伏期之后，中间产物发生了变化，增加了2mmol/l 谷氨酸盐，25ug/ml 庆大霉素，100 nmol/l 地塞米松，10mmol/l 的乳酸盐和5.5mol/l 的 D-葡萄糖经过隔夜培养在指定的时间新鲜培养基中增加 2mmol/l 谷氨酸盐，25ug/ml 庆大霉素，和 100 nmol/l 地塞米松后细胞培养出来，就像结果中所描述的那样有不同的化合物正如前文所描述那样，细胞在放线菌素 D 中培养，就像图例所显示 D-葡萄糖加入培养基中。

RNA提取及定量PCR分析 根据厂商说明使用Trizol试剂使得全部RNA从肝脏和原代肝细胞中分离RNA通过使用随机六聚体引物和200单位MMLV逆转录酶进行逆转录在MX-4000装置使用特异性引物（FXR前方：5-CCA ACC TGG GTT TCT ACCC-3; FXR 反方向: 5-CAC ACA GCT CAT CCC CTT T-3; SHP前方: 5-ACT GCC TGT GCC AGC AAC AC-3; SHP反方向: 5-AGC CGT CGC TGA TCC TCA TG-3; Cyp7a1前方: 5-ATG ATG ACT ATT TCT TTG ATT TGG GGA-3; Cyp7a1反方向: 5-CTT CTG TGT CCA AAT GCC TTC GCA GAA-3;LPK前方: 5-CGT GCG AGT GTG GCT CAA CTG ACC C-3; LPK反方向:5-GTC GTC AAT GTA GAT GCG GCC CCC C-3; apo C-III前方: 5-GAA CAA GCC TCC AAG ACG GT-3; apo C-III反方向: 5-GGG ATT TGA AGC GAT TGT CC-3; 36B4前方: 5-CAT GCT CAA CAT CTC CCC CTT CTC C-3; 和36B4反方向: 5-GGG AAG GTG TAA TCC GTC TCC ACA G-3)进行及时定量PCR反应对FXR，SHP,Cyp7a1,LPK, apo C-III和36B4 mRNA进行了量化。

PCR扩增在25微升的容积中进行，溶剂中包含 100nm/l的各自引物， 4mmol/l氯化镁，PCR核心试剂以及荧光染料0.33X在 95℃条件下10分钟，随后是在95°C条件下30秒,在55°C条件下30秒和在72°C 条件下30秒进行40周期后mRNA正常化为36B4mRNA电泳迁移分析 电泳迁移分析（EMSAs）使用放射性标记FXRE共识探头对于使用核提取物的实验在4℃消除过多的盐份进行一小时透析和纯化蛋白质核提取物使用电泳迁移实验在4℃条件下30分钟进行培养，在使用探针技术后在相同条件下进行30分钟对于这个实验，0.2微克抗FXR抗体在结合除了探头的设备20分钟被培养出来统计分析 通过使用T检验或U检验分析由统计学意义P＜0.05认为有统计学意义结论在糖尿病鼠中肝 FXR 基因表达减少 要确定在体内高血糖的条件下是否对 FXR 基因进行调节，在链脲霉素注射诱导的糖尿病鼠中检测肝 FXRmRNA 水平在 STZ-诱导的糖尿病鼠中血糖水平要高于控制组或者胰岛素治疗组动物STZ-诱导的糖尿病鼠与控制组比较，肝FXRmRNA 的表达显著降低有趣的是，对于胰岛素调节的糖尿病鼠恢复 FXRmRNA 水平与对照组动物相似。

表 1 FXR 表达在糖尿病鼠模型中减少ZDF 鼠和 ZLC 鼠（每组 8 个）肝脏分为治疗组或者 STZ 诱导糖尿病鼠而没用胰岛素治疗或使用胰岛素治疗组，就像研究设计和方法所描述的那样，使用 PCR 定量分析测得FXRmRNA 水平（C） FXRmRNA 水平和 36B4mRNA 相比是正常的B;血糖水平来自一般治疗 STZ 诱导的糖尿病鼠或胰岛素治疗 STZ 诱导的糖尿病鼠D; 不同年龄段的 ZDF 和 ZLC 鼠的血糖和胰岛素水平数据用均数±标准差表示在控制组和第六周 ZDF/ZLC 或 ZDF 和 ZLC 之间任何年龄表明都有统计学意义为了评估肝脏 FXR 表达是否在 2 型糖尿病模型中发生了改变，研究了随着年龄的增长而逐渐发展为 2 型糖尿病的 ZDF 鼠模型年龄相匹配的 ZDF 和 ZLC 控制组老鼠的分析显示在 ZDF 鼠中血糖水平逐渐增加相反，血浆胰岛素水平在 6 周龄非常高，说明存在着胰岛素抵抗，从那之后随着糖尿病的进展逐渐减少ZDF 鼠与年龄相匹配的 ZLC 鼠想比较，肝 FXRmRNA 水平显著提高有趣的是，肝 FXRmRNA 水平随着 ZDF 鼠年龄的逐渐增长而降低。

在 ZDF 鼠第二十周，肝 FXRmRNA 水平同第六周 ZLC 鼠肝 FXRmRNA 水平相似同 ZDF 鼠相比，瘦的 ZLC 鼠在 20 周显示肝 FXRmRNA 水平增高，而这是与随着年龄增长血糖浓度增高相适应的为了证明在糖尿病模型中肝 FXRmRNA 表达的降低是否与 FXR 靶基因表达的改变有联系，分析 Cyp7a1 的表达肝 Cyp7a1 表达在 STZ 诱导的糖尿病鼠中有增加的趋势，而在胰岛素治疗后趋于正常在 ZDF 鼠中肝脏 Cyp7a1 的表达随着年龄的增长逐渐增加三种结果表明肝脏 FXR 表达的调节受血糖稳态改变状况的影响表 2 在糖尿病鼠中肝 Cyp7a1 表达水平在肝脏样本中通过 PCR 定量分析检测 Cyp7a1mRNA（表1）以及同 36B4mRNA 比较趋于正常化数据用均数±标准差表示来自第六周的 ZDF 表明差别有统计学意义在鼠肝细胞中 D-葡萄糖诱导以剂量依赖和时间依赖方式诱导 FXR 表达 在血糖和胰岛素改变的条件下开始决定这些因素调节肝 FXR 的表达，非糖尿病鼠中原代培养的肝细胞中分析了 FXRmRNA 对血糖和胰岛素的影响，经常用于研究胰岛素和血糖调节的基因表达的模型。

原代大鼠肝细胞的培养在 1nmol/l 胰岛素的情况下有高浓度的 D-葡萄糖导致时间依赖的。