分子生物学第三章-DNA结构.ppt

Chapter 3DNA’s structureAntiparallel反向平行 strands of the double helix are organized in opposite orientation, so that the 5′ end of one strand is aligned with the 3′ end of the other strand.Base pairing 碱基配对describes the specific (complementary) interactions of adenine腺嘌呤with thymine胸腺嘧啶or of cytosine胞嘧啶with guanine鸟嘌呤 in a DNA double helix (the former is replaced by adenine with uracil尿嘧啶in double helical RNA).Complementary 互补base pairs碱基对are defined by the pairing reactions in double helical nucleic acids (A with T in DNA or with U in RNA, and C with G).Supercoiling超螺旋describes the coiling of a closed duplex DNA in space so that it crosses over its own axis.DNA is a double helix双螺旋双螺旋3.1 DNA 的一级结构•定义：核苷酸排列顺序，或称碱基排列顺序。

• 5’-ATCGGCTAAGGCTCCGACGA--3’ • 3’-TAGCCGATTCCGA GGCTGCT--5’ •人类基因组计划――20 世纪生物学最宏伟计划：人类基因组的作图与测序人类基因组计划（1990-2005）；计划耗资30 亿美元人类基因组有30 亿碱基对的测序A polynucleotide多(聚)核苷酸　chain consists of a series of 5￠-3￠ sugar异戊糖（环形五碳糖） -phosphate磷酸脂基links that form a backbone from which the bases protrude•碱基与糖的结合物称为核苷核苷，如果再与一个磷酸脂基相连则形成核苷酸核苷酸nucleotide acid•核苷酸核苷酸•嘧啶嘧啶•嘌呤嘌呤核苷核苷 nucleotidenucleotide糖与碱基之间的糖与碱基之间的C-NC-N键，称为键，称为C-NC-N糖苷键糖苷键核苷酸核苷酸nucleotidenucleotide•核苷酸是核苷的磷酸酯作为核苷酸是核苷的磷酸酯作为DNADNA或或RNARNA结构单元的核苷酸分结构单元的核苷酸分别是别是5′-5′-磷酸磷酸- -脱氧核糖核苷和脱氧核糖核苷和5′-5′-磷酸磷酸- -核糖核苷。

核糖核苷• 由脱氧核糖和磷酸构成DNA主链（或骨架），其结构单元（由脱氧核糖和磷酸构成）是彼此相同的对各种DNA一级结构而言，相互间的差别主要是在于所含的碱基的组成、数量及排列顺序上因此，在描述DNA的一级结构时，总是以其所含碱基的序列为准，并用碱基的第一个英文字母构成的字符串来表示如：5’dACGTCCTATTCGGT……3’PP5'3'3'5'PP5'3'P5'ACGTThe double helix maintains a constant width because purines嘌呤always face pyrimidines嘧啶in the complementary A-T and G-C base pairs. The sequence in the figure is T-A, C-G, A-T, G-C.• DNA的一级结构涉及脱氧核糖核苷酸的种类、数量、排列位置和键连接关系•DNA分子在一级结构层次上是由许多脱氧核苷酸分子连接而成的多聚脱氧核苷酸长链分子，通常将链短者称为脱氧寡核苷酸（deoxyoligonucleotide）•在DNA分子中，脱氧核苷酸之间是通过磷酸二酯键连接起来的。

•多数DNA是线型分子，也有少数是环形分子当线型多聚脱氧核糖核苷酸链的3’端羟基与其5’端的磷酸残基缩合成酯后（即形成磷酸二酯键二连接起来），成为环形的DNA•快速而精确的测定合分析核酸的一级结构，是核酸研究的一项关键技术目前应用的2种DNA序列测定技术是Sanger等提出的酶法（Sanger method）合Maxam和Gilbert提出的化学降解法（Maxam－Gilbert method）SangerSanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法•DNA的合成总是从5′端向3′端进行的DNA的合成需要模板以及相应的引导核酸链DNA的合成过程中，在合成的DNA链的3′末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3′，5′－磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链•具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列。

MaxamMaxam－－Gilbert DNAGilbert DNA化学降解法化学降解法• 该方法的基本步骤为•(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P）•(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰•(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链•(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开•(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列 •在这两种方法中，利用化学降解法进行DNA测序具有较高的重现性，而且也容易为一般研究人员所掌握它的明显优点是其所测定的序列是来自DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此，利用化学降解法可对合成寡核苷酸进行直接测序，可以分析注入甲基化等DNA修饰的情况还可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及DNA－蛋白质相互作用•Sanger的酶法则需要有单链模板和特异的寡核苷酸引物，而且还需要高质量的聚合物制剂因其简便快速，仍然被广泛的应用•DNA一级结构是DNA结构层次中的基础层次，不仅是认识和研究二级结构和三级结构的基础，同时是进一步分析DNA结构－功能关系的前提，而且有利于基因表达、调节和控制等多项分子生物学的研究。

3.2 DNA 的二级结构•即双螺旋结构受环境因素, 如平衡离子类型、离子强度、特异结合蛋白、水合状态等的影响, 以及DNA 分子碱基的组成都可促使DNA 分子取不同的构象• DNA 分子存在多种构象•㈠B 型结构: （右手双螺旋） 这是水溶液（或相对湿度92%以上）中的主要构象•㈡A 型结构：相对湿度<75%，矮胖型，直径大•㈢Z 型结构 ：Wang 等人在研究人工合成的d(CGCGCG)单晶的X-射线衍射图谱发现主链呈锯齿排列DNA的双螺旋结构的双螺旋结构•不同物种DNA中各种碱基的含量不同，这个结果启发人们：碱基序列正是遗传信息的载体形式•到二十世纪五十年代，遗传信息的概念已经被人们广泛的认同，但同时也提出了两个新的课题•一个是DNA的结构•另一个是碱基序列是如何编码蛋白质的氨基酸序列的三个方面的发现•1953年，基于三个方面的发现，Watson和Crick提出了双螺旋模型：•*X光衍射实验数据表明DNA是一种规则螺旋结构：每3.4nm旋转一周，直径约为2nm因为相邻核苷酸距离为0.34nm，因此每圈有10个核苷酸单位•*DNA密度测量说明这种螺旋结构应有两条链这样如果两条链间的碱基都是朝里而且严格的按嘌呤对嘧啶排列，螺旋直径保持不变就很容易解释，否则，嘌呤对嘌呤则太粗，嘧啶对嘧啶则太细。

•*不论碱基数目多少，G的含量总是与C一样，而A与T 也是一样因此通常以G+C的含量来描述DNA的组成不同物种G+C的含量一般在26~74%•DNA中两条核苷酸链是以碱基间的氢键相连的•在通常状况下，G只与C特异性的以氢键相接，而A则只与T相作用这种反应称之为碱碱基基互互补补反反应应，而配对的碱基则被称之为互补互补（A与T，G与C）•在这种模型中，两条核苷酸链是反向的（反反平平行行），沿着螺旋旋转方向，一条是5’-3’方向，而另一条是3’-5’方向•糖基-磷酸脂基构成的主链暴露在外表面，并带有磷酸脂基的负电荷当DNA处于体外溶液时，电荷被一些能与之结合的金属离子，一般是Na+，所中和；而在活体内，则是由带正电荷的蛋白质提供中和电荷这些蛋白质在决定DNA的内型上起着很重要的作用碱基处于双螺旋结构的内部，平面结构，垂直于螺旋轴成对排列•双螺旋体类似于盘旋的楼梯：碱基对如同踏板，顺着螺旋，碱基一个堆一个，像一叠盘子The two strands of DNA form a double helix. Base pairs fill the center of the helix; the phosphates ( ) are on the outside.The B-form DNA helix has a diameter of about 20 Å~20 ÅA base pair is more exposed to the solvent on one side (the “major groove”, at the top in these views) than the other (the “minor groove”, bottom).B-form DNA consists of a right-handed double helix with antiparallel strands34 Å (10 bp) per turnmajor grooveminor groovemajor grooveminor3.4 Å per bpThese dimensions are for DNA fibers. In solution, there are ~10.5 base-pairs per turn.5’3’5’3’•湿度影响DNA的结构。

脱水会使B型转换成A型生理状态下，dsRNA和RNA:DNA杂交体都为A型A型缺乏柔韧性，比B型难融解在体内B-DNA占绝大多数A型和B型的重复单位都是一个碱基对，而Z型为2个碱基对，一般为嘌呤和嘧啶交替组成，如oligo-dGdC, oligo-dAdT等•B-DNA: B-DNA的钠盐结构是由两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴构成的右手螺旋结构多核苷酸的方向由核苷酸间的磷酸二酯键的走向决定，一条从5’- 3’，另一条从3’- 5’链间形成一条较浅的小沟和一条较深的大沟两条链上的碱基以氢键相连，G与C配对，A与T配对双螺旋的中心轴与碱基平面垂直，并穿过氢键的中点相邻碱基对平面间的距离为0.34nm，绕螺旋轴旋转约36度这样约10个碱基对旋转一周碱基对层叠于双螺旋的内侧，磷酸与脱氢核糖在外侧脱氧核糖环平面与双螺旋的中心轴大致平行双螺旋的直径为2.0nm•C-DNA是在特定的盐和湿度（相对湿度44％-66％）条件下A型和B型之间的中间产物，属于B族DNA•D-DNA也是B族DNA的一员天然DNA一般不采取D型双螺旋结构但是当DNA中有A,T顺序交替的富含AT区域，可能采取D型Z-型DNA构象的主要特征•糖 -磷酸主链的走向呈之字形, 分子呈左手螺旋构象，每一螺圈含12 对碱基, 距离为 4.46nm 。

•糖环折叠不同于A 或B 型DNA, 鸟嘌呤碱基绕糖苷键旋转呈顺式构型,而嘧啶碱基仍是反式构型• Z-DNA 仅有一条小沟, 且较深, 含有较高的负电荷密度• Z-DNA 较B-DNA 细而“舒展”, 螺旋直径为1.8nm •维系DNA二级结构的主要作用力是氢键和碱基堆集力,而磷酸基的负电荷和碱基内能则不利于双螺旋结构的稳定•在生理状况下,双螺旋的碱基对之间氢键不断地发生断裂和再生,这就是DNA的所谓呼吸作用•DNA在热或其他变性剂作用之下,双链发生分离,即变性作用变性的DNA单链在适合的条件下又能恢复双螺旋结构,即复性作用基于DNA的变性作用和复性作用,产生了十分有用的分子杂交技术DNA 二级结构的其他构象•反向重复序列: 在同一多核苷酸链内的相反方向上存在的重复的核苷酸序列•在双链DNA中反向重复可能引起十字形结构的形成AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 2 8 14 20281420•富含G单链: 可以形成多种稳定的G4结构•DNA 的四链结构特征：①鸟嘌呤四联体；②G-G 首尾相接，异常氢键；③片层堆积，所有的方向一致。

•研究发现，各种端粒DNA都具有富含G链的简单重复序列DNA序列上的这种特殊性提示我们端粒可能需要这种特殊的序列以形成特殊的结构•大量的体外实验表明，富含G单链可形成各种稳定的G4结构(G4 structure) •四链DNA结构的稳定性及其影响因素一直是研究的热点体外实验表明，四链结构具有高熔解温度，甚至可以达到100℃，，最初认为是在2层G4体之间螺旋轴附近插入了一个水分子并与碱基形成氢键而稳定其结构在其后的研究中发现碱金属离子对其形成与稳定性有很大影响，特别是K+和Na+离子三螺旋DNA•存在条件：一条全嘌呤,另一条全嘧啶•特征：•①两条全嘧啶链和一条全嘌呤链组成三螺旋结构；•②氢键为Hoogsten 氢键；•③第三条链位于正常双螺旋的大沟中 •三链DNA既可以是B-DNA与另一条DNA链结合成的链间的三链DNA，又可以是B-DNA与其自身的一条链结合形成的链内的三链DNA•分子内三链DNA于1987年由Mirkin在超螺旋中发现其形成要求双螺旋中存在连续的嘌呤或嘧啶序列，而且必须是镜像重复序列•镜像重复序列：由反方向完全相同的两个序列组成5 ′GGAATCGATCTTTTCTAGCTAAGG 3 ′3′CCTTAGCTAGAAAAGATCGATTCC 5′•反转重复（inverted repeated)：由反方向互补的两个DNA片段组成，两个反转重复序列又叫回文序列(palindrome sequence)。

•镜像重复(mirror repeat)：由反方向完全相同的两个序列组成•直接重复(direct repeat)：由同一方向完全相同的两个序列组成正向重复序列、顺向重复序列3.3 DNA的三级结构——超螺旋（supercoil）•生物体闭环DNA都以超螺旋形式存在，如细菌质粒、病毒、线粒体DNA线性DNA分子或环状DNA分子中有一条链有缺口时不能形成超螺旋•超螺旋的意义：紧密，体积更小；能影响双螺旋的解链程序，因而影响DNA分子与其它分子之间的相互作用•真核生物染色体三级结构：生物界内生物界内DNADNA都是负超螺旋，并由拓扑异构酶产生都是负超螺旋，并由拓扑异构酶产生Ø拓扑异构拓扑异构酶I • 切开双切开双链DNA的一条的一条链并将切口并将切口连接，不需要接，不需要ATP水解供能，一般是使超螺旋水解供能，一般是使超螺旋变为松弛型E.Coli拓扑异拓扑异构构酶I(ω蛋白蛋白)对单链DNA亲和性和性较高高,易易识别负超螺旋拓扑异构拓扑异构酶I序列特异性很差；序列特异性很差； Ø拓扑异构拓扑异构酶II •可同可同时切断切断DNA的两条的两条链，需要，需要ATP水解供能分水解供能。

分为两个两个亚类，作用分，作用分别是引入是引入负超螺旋和解开超螺旋超螺旋和解开超螺旋 E.Coli的旋的旋转酶(gyrase)可从松弛型可从松弛型DNA和正超螺旋中和正超螺旋中引入引入负超螺旋，需要超螺旋，需要ATP，，当缺乏当缺乏ATP时可松弛正、可松弛正、负超螺旋超螺旋形成：超螺旋形成： 首先断开其中一条首先断开其中一条 链然后将然后将DNA链旋旋 转或扭或扭转连合缺口合缺口Ø原核生物原核生物DNA超螺旋由拓扑异构超螺旋由拓扑异构酶诱导形成，其首形成，其首先断开其中一条（先断开其中一条（酶I））或两条（或两条（酶II））链然后将然后将DNA链旋旋转或扭或扭转再再连合缺口，由合缺口，由ATP水解提供能水解提供能量（一个量（一个ATP可用于形成一个超螺旋）拓扑异构可用于形成一个超螺旋）拓扑异构酶亦解除超螺旋但不需能亦解除超螺旋但不需能 Ø真核生物中真核生物中负超螺旋是由超螺旋是由DNA与与组蛋白蛋白结合形成核合形成核小体达到的，小体达到的，DNA以左手螺旋方向以左手螺旋方向缠绕在核小体上在核小体上 Ø负超超螺螺旋旋有有利利于于DNA螺螺旋旋解解旋旋暴暴露露不不配配对的的核核苷苷酸酸以以进行行转录，，复复制制及及遗传重重组。

同同时负超超螺螺旋旋利利于于B型型转化化为Z-DNA，，提提高高或或抑抑制制蛋蛋白白-DNA的的结合合，，或或参与原核生物基因的参与原核生物基因的调控3.4 真核生物染色体真核生物染色体一、染色体、染色质一、染色体、染色质染色体染色体：真核生物的染色体都包含一个很长的线性：真核生物的染色体都包含一个很长的线性DNADNA分分子，并被组装在细肥核内，在细胞生活的大部分时间里子，并被组装在细肥核内，在细胞生活的大部分时间里以染色质的形式存在以染色质的形式存在染色质染色质－由－由DNA和蛋白质和蛋白质(组蛋白和非组蛋白组蛋白和非组蛋白)组成染色组成染色质丝，是细胞核染色体主要存在形式；质丝，是细胞核染色体主要存在形式；DNA与组蛋白与组蛋白形成核小体在缠绕形成螺线管，进一步折叠形成染色体；形成核小体在缠绕形成螺线管，进一步折叠形成染色体； 常染色质常染色质－折叠程度较低－折叠程度较低(1000~2000倍倍)，染色较浅，染色较浅;异染色质异染色质－折叠程度较高－折叠程度较高(10000倍倍)，染色较深分为组，染色较深分为组成型异染色质和机动性异染色质，组成型异染色质从不成型异染色质和机动性异染色质，组成型异染色质从不转录转录(卫星卫星DNA)，，机动性异染色质可转变为常染色质可机动性异染色质可转变为常染色质可转录，如两条转录，如两条X染色体的一条呈异染色质化表现随机失染色体的一条呈异染色质化表现随机失活。

活二、核小体二、核小体1 1、、发发现现：：用用微微球球菌菌核核酸酸酶酶处处理理染染色色质质，，会会得得到到200200bpbp的多个片段的多个片段核酸酶：外切核酸酶：外切E E、、内切内切E E2 2、、核核小小体体：：是是构构成成真真核核生生物物染染色色质质的的基基本本结结构单位，是构单位，是DNADNA和和PrPr构成的紧密结构形式构成的紧密结构形式nOlins夫妇（1974）和Pierre Chambon等（1975）在电镜下观察到染色质的“绳珠”状结构，小球的直径为100埃,Olins并把这种小球称为 小体小体 H32-H42 八聚体八聚体 核心颗粒核心颗粒 2×H2A-H2B 染色质小体染色质小体 (～～166bp) 核小体核小体 DNA 166bp 146bp (～～200bp) H1 20bp DNA连接区连接区 (常为常为32～～34bp) 核小体的组成核小体的组成DNA与与组蛋白蛋白组成核小体是染色成核小体是染色质的基本的基本结构构单位，其将位，其将DNA装配装配为稳定螺旋形式参与基因定螺旋形式参与基因调控如使得催化控如使得催化转录的的酶暂时不能与不能与DNA接触接触。

• 组蛋白结构特征： 1））进化上极端保守进化上极端保守：：核心核心组蛋白在物种蛋白在物种间较保保守，尤其在高等真核生物中守，尤其在高等真核生物中H3和和H4最保守，最保守，其次其次H2A，，H2B，， H1变化最大变化最大如哺乳如哺乳动物物间有有20%差异，高等植物差异，高等植物键则有有75%差异且H1物种内甚至不同物种内甚至不同类型型细胞胞间亦有不同亦有不同变异体H1的作用是与线形的作用是与线形 DNA结合以帮助后者形结合以帮助后者形成高级结构成高级结构生生长和分裂和分裂过程程产生的生的组蛋白蛋白变异体表明不同异体表明不同组蛋白的蛋白的组合合对正常生正常生长分裂很分裂很重要2）无组织特异性：）无组织特异性：仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不体不含含H1而带有而带有H5精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白是例外 3）肽链上氨基酸分布的不对称性：肽链上氨基酸分布的不对称性： 组蛋白靠静蛋白靠静电吸引作用吸引作用结合于染色合于染色质可用酸或可用酸或盐提取，提取，从所有真核生物中均可提取到五种从所有真核生物中均可提取到五种组蛋白，即蛋白，即H1，，H2A，，H2B，，H3和和H4。

组蛋白的碱性来自蛋白的碱性来自赖氨酸和精氨酸残基氨酸和精氨酸残基并集中在并集中在N末端形成臂，正末端形成臂，正电荷与荷与DNA上磷酸基上磷酸基负电荷互荷互作，作，组蛋白蛋白C末端形成球形疏水残基末端形成球形疏水残基较多可多可与其他与其他组蛋白蛋白及及非非组蛋白蛋白结合结合4）组蛋白的化学修蛋白的化学修饰：组蛋白的氨基酸残基可被乙基，甲蛋白的氨基酸残基可被乙基，甲基及磷酸基等修基及磷酸基等修饰而去除了其正而去除了其正电荷因而与荷因而与DNA的的结合减合减弱这些修些修饰可参与核小体可参与核小体组装，基因装，基因调控，控，DNA复制，复制，细胞分裂及胞分裂及DNA浓缩如乙酰化有利于核小体化有利于核小体组装及活化装及活化基因利于基因利于转录.5）富含赖氨酸的组蛋白）富含赖氨酸的组蛋白H5：： 推测的磷酸化在染色质失活作用中起重要作用推测的磷酸化在染色质失活作用中起重要作用染色体上除了存在大约与染色体上除了存在大约与DNA等量的组蛋白以外，等量的组蛋白以外，还存在大量的非组蛋白占组蛋白总量的还存在大量的非组蛋白占组蛋白总量的60%-70%，种类很多约，种类很多约20-100种，常见种，常见15-20种。

种包括：酶类，如包括：酶类，如RNA聚合酶及细胞分裂有关的收缩聚合酶及细胞分裂有关的收缩蛋白、骨架蛋白、核孔复合物蛋白以及肌动蛋白、蛋白、骨架蛋白、核孔复合物蛋白以及肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白、原肌蛋白等，他们也可能是肌球蛋白、微管蛋白、原肌蛋白等，他们也可能是染色质的结构成分染色质的结构成分2 2、、核小体的装配：核小体的装配： 组组PrPr八八聚聚体体的的装装配配：：2 2H3H3、、2H42H4形形成成四四聚聚体体+ +H2AH2A、、H2BH2B异异二聚体二聚体 组组PrPr不带电荷部分向着核心，带正电荷部分在表面不带电荷部分向着核心，带正电荷部分在表面 DNADNA与组与组PrPr八聚体的组装：八聚体的组装： 146146bpbp绕绕 八八 聚聚 体体 1.81.8圈圈 （（ 左左 向向 ）） + +H1H1覆覆 盖盖 部部 分分（（2020bpbp））=166bp+=166bp+连接连接DNADNA（（0 0——100bp100bp））总之：染色体的组装大体步聚为：总之：染色体的组装大体步聚为： DNA+DNA+组组Pr --- Pr --- 核小体核小体 （（7 7倍）倍） 绕成绕成3030nmnm的纤丝即线管（每圈的纤丝即线管（每圈6 6个核小体，个核小体，6 6倍）倍） 细长、中空的圆筒细长、中空的圆筒 （（4040倍）倍） 超螺旋圆筒进一步压缩成为染色体单体（超螺旋圆筒进一步压缩成为染色体单体（5 5倍）倍） 核小体核小体（11nm）染色质染色质组装组装－－染色质的四级结构染色质的四级结构螺线管螺线管（30nm）超螺线管超螺线管（300nm）染色单体染色单体压缩压缩6倍倍压缩压缩40倍倍压缩压缩5倍倍DNA压缩压缩10倍倍组蛋白组蛋白+一级一级二级二级三级三级四级四级30nm螺旋管核小体的结构•核小体的形状类似一个扁平的碟子或一个圆柱体，直径为11 nm，高6 nm•染色质就是由一连串的核小体所组成。

当一连串核小体呈螺旋状排列构成纤丝状时，DNA的压缩包装比约为40•纤丝本身再进一步压缩后，成为常染色质的状态时，DNA的压缩包装比约为1000•有丝分裂时染色质进一步压缩为染色体，压缩包装比高达10 000，即只有伸展状态时长度的万分之一。