植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测ppt课件.ppt

农业生物学实验教学中心植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测刘红梅植物基因组 DNA的提取琼脂糖凝胶电泳检测n脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)、核糖核酸、核糖核酸(RNA) (RNA) n与蛋白质结合在一同以核蛋白〔与蛋白质结合在一同以核蛋白〔DNPDNP〕的方式存在〕的方式存在在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来释放出来n植物总植物总DNADNA包括细胞核包括细胞核DNADNA和细胞核外和细胞核外DNA,DNA,前者存在前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)DNA(mtDNA)和叶绿体和叶绿体DNA(ctDNA)DNA(ctDNA)背景知识背景知识核酸的存在方式核酸的存在方式nDNADNA为白色类似石棉样的纤维状物，为白色类似石棉样的纤维状物， RNA RNA的纯品呈的纯品呈白色粉末或结晶核酸和核苷酸大都呈酸味白色粉末或结晶核酸和核苷酸大都呈酸味 nDNADNA、、RNARNA和核苷酸都是极性化合物，普通都溶于和核苷酸都是极性化合物，普通都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。

游离酸易溶于水n在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定中较稳定 核酸的理化性质核酸的理化性质细胞破碎细胞破碎 抽提去蛋白质抽提去蛋白质 沉淀核酸沉淀核酸根本过程根本过程 ① ①机械方法：机械方法： 超声波超声波处置法、研磨法、匀置法、研磨法、匀浆法；法； ② ②化学化学试剂法：用法：用SDSSDS处置置细胞；胞； ③ ③酶解法：解法： 参与溶菌参与溶菌酶或或蜗牛牛酶，破坏，破坏细胞壁 细胞破碎细胞破碎 uSDSSDS法法 SDSSDS是是有有效效的的阴阴离离子子去去垢垢剂剂, , 细细胞胞中中DNADNA与与蛋蛋白白质质之之间间 常常借借静静电电引引力力或或配配位位键键结结合合, , SDSSDS可可以以破破坏这种价键坏这种价键uCTABCTAB法法 CTABCTAB是是一一种种阳阳离离子子去去垢垢剂剂，，它它可可以以溶溶解解膜膜与与脂脂膜膜，，使使细细胞胞中中的的DNA-DNA-蛋蛋白白质质复复合合物物释释放放出出来来，，并并使蛋白量变性，使使蛋白量变性，使DNADNA与蛋白质分别。

与蛋白质分别DNADNA提取提取u蛋白质蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇〔常用苯酚：氯仿：异戊醇〔2525：：2424：：1 1〕〕或氯仿：异戊醇〔或氯仿：异戊醇〔2424：：1 1〕抽提uRNA RNA 常选用常选用RNaseRNase消化消化 ，或是用，或是用LiClLiCl来消除大分来消除大分子的子的RNARNAu酚类物质酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的资料u多糖多糖 提取液中加提取液中加1 1％％PVPPVPDNADNA纯化〔去杂质〕纯化〔去杂质〕实验资料料 新新颖蔬菜叶片蔬菜叶片( (去叶脉去叶脉) )试剂 2×CTAB 2×CTAB抽提液抽提液 TE TE 缓冲液冲液(pH=8.0) (pH=8.0) 氯仿：异戊醇仿：异戊醇(24:1)(24:1) 资料与试剂资料与试剂①①离心机离心机 ②②水浴水浴锅③③研研钵 ④④微量移液器微量移液器仪器器具仪器器具移液器－量程的选择移液器－量程的选择1．取．取 2g 清洗凉干的新清洗凉干的新颖颖叶片于研叶片于研钵钵中，加中，加 1/3 药药匙石英砂和匙石英砂和 4mL 2 倍的倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。

提取液，迅速研磨2．将．将 1mL 研磨液研磨液转转入入 1.5mL 离心管中，置于离心管中，置于65℃水浴中保水浴中保温温 20min，其，其间颠间颠倒混匀倒混匀2－－3次破碎细细胞胞3. 12000r/min 离心离心 5min，取上清液，取上清液700μL转转到另一离心管到另一离心管中参与等体中参与等体积氯积氯仿：异戊醇仿：异戊醇〔 〔24:1〕 〕混合液，充分混合液，充分颠颠倒混倒混匀12000r/min，离心，离心 5min抽提去蛋白抽提去蛋白4．将上清液移入新的．将上清液移入新的1.5mL离心管内，加离心管内，加 600µL异丙醇颠颠倒混匀，可倒混匀，可见见 DNA 絮状沉淀沉淀核酸絮状沉淀沉淀核酸5．．12000r/min，离心，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置枯，倒掉上清液，将离心管倒置枯燥 将沉淀回溶于将沉淀回溶于20µL TE 缓缓冲液待冲液待测测操作步骤操作步骤1)选取新颖资料，研磨迅速彻底，研磨好的资料应与选取新颖资料，研磨迅速彻底，研磨好的资料应与 CTAB 抽提抽提液充分混匀；液充分混匀；2)假设提取产物有颜色，能够是资料中含有较多的多酚类物质，假设提取产物有颜色，能够是资料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇〔添加巯基乙醇〔2－－5％〕，尽能够选取幼嫩的资料；％〕，尽能够选取幼嫩的资料；3〕搜集〕搜集 CTAB 与核酸构成的复合物时不要离心过度，否那么沉淀与核酸构成的复合物时不要离心过度，否那么沉淀再溶解难；再溶解难；4〕为了获得具有生物活性的天然核酸，在分别制备过程中必需采〕为了获得具有生物活性的天然核酸，在分别制备过程中必需采用温暖的条件，防止过酸过碱、猛烈地搅拌，防止热变性，同用温暖的条件，防止过酸过碱、猛烈地搅拌，防止热变性，同时还要防止核酸降解酶类的降解。

时还要防止核酸降解酶类的降解本卷须知本卷须知DNADNA分子在高于等分子在高于等电电点的点的PHPH溶液中溶液中带负带负电电荷，在荷，在电场电场中向中向正极挪正极挪动动在一定电场电场强强度下，度下，DNADNA分分子的迁移速度与相子的迁移速度与相对对分子分子质质量的量的对对数数成反比电泳原理电泳原理琼脂糖是一种脂糖是一种线性多糖聚合物性多糖聚合物浓度越高，孔隙越小，其分辨才干就越度越高，孔隙越小，其分辨才干就越强琼脂糖浓度琼脂糖浓度琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)(%)线型线型线型线型DNADNA分子的分离范围分子的分离范围分子的分离范围分子的分离范围(Kb)(Kb)0.30.35 5～～～～60600.60.61 1～～～～20200.70.70.80.8～～～～10100.90.90.50.5～～～～7 71.21.20.90.9～～～～6 61.51.50.20.2～～～～3 312.012.00.10.1～～～～2 2仪器和试剂仪器和试剂仪器仪器电泳仪电泳仪电泳槽电泳槽灌胶模具等灌胶模具等–Tris-硼酸〔硼酸〔TBE〕〕– Tris-乙酸〔乙酸〔TAE〕〕– Tris-磷酸〔磷酸〔TPE〕〕常用电泳缓冲液常用电泳缓冲液 电泳指示泳指示剂溴酚溴酚兰在碱性液体中呈紫在碱性液体中呈紫兰色，普通色，普通与蔗糖、甘油或聚蔗糖与蔗糖、甘油或聚蔗糖400400组成上成上样缓冲液。

冲液 作用：作用：①①添加添加样品比重，以确保品比重，以确保DNADNA均匀沉入加均匀沉入加样孔内②②构成肉眼可构成肉眼可见的指示的指示带，，预测核酸核酸电泳的速度泳的速度和位置③③使使样品呈色，使加品呈色，使加样操作更方便操作更方便上样缓冲液上样缓冲液溴化乙锭〔溴化乙锭〔EBEB〕〕是一种荧光染料，是一种荧光染料，EBEB分子可嵌入核酸双链分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光其荧光强度与色荧光其荧光强度与DNADNA的含量成正比的含量成正比据此可粗略估计样品据此可粗略估计样品DNADNA浓度 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶EBEB染色，肉眼可见核酸电泳带，染色，肉眼可见核酸电泳带，其其DNADNA量普通量普通>5ng>5ng核酸染色剂核酸染色剂本卷本卷须知：知：EBEB是致癌物是致癌物质，切勿用手接触，，切勿用手接触，更不要更不要污染染环境–DNADNA分子量规范分子量规范不不同同种种类DNA Marker1.1.凝胶制凝胶制备备 制制备备0.8%0.8%琼琼脂糖凝胶称取适量脂糖凝胶称取适量琼琼脂糖参脂糖参与与 20mL 0.5×TBE 20mL 0.5×TBE，加，加热热至至琼琼脂糖全部熔化，冷却至脂糖全部熔化，冷却至50-50-60℃ 60℃ 时时，参与，参与 EB EB 至至终浓终浓度度 0.5µg/mL 0.5µg/mL。

缓缓慢倒入胶板，慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子待胶凝固后拔出梳子2.2.加加样样 取取10µl DNA10µl DNA样样液与液与 2µl 2µl 上上样样 buffeer buffeer 混匀，用混匀，用微量移液器小心参与微量移液器小心参与样样品槽3.3.电电泳泳 接通接通电电源，切源，切记记接近加接近加样样孔的一端孔的一端为负为负，，电压为电压为1~5V/cm1~5V/cm〔 〔长长度以两个度以两个电电极之极之间间的的间间隔隔计计算算〕 〕, ,待溴酚待溴酚兰兰挪挪动动到一定位置，停到一定位置，停顿电顿电泳4.4.察看拍照察看拍照四、操作步骤四、操作步骤紫外仪上察看电泳带及其位置紫外仪上察看电泳带及其位置绘制核酸电泳表示图绘制核酸电泳表示图 作业1.1.结结合合原原理理，，简简述述CTABCTAB法法分分别别提提取植物总取植物总DNADNA的根本过程的根本过程2.2.为为了了获获得得高高质质量量的的植植物物总总DNADNA，，在在分分别别提提取取过过程程中中应应留留意意那那些问题？些问题？What?!How?!思索思索。