【2017年整理】FKY第六次讨论.doc

脂肪酶的有机介质催化及优势生物技术 091 方言康 2009016257一、脂肪酶机构功能关系脂肪酶的分子量在 20，000 至 60，000 之间，脂肪酶拥有亲核试剂-组氨酸-酸式残基组成的三元基团，该三元集团是丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸或者丝氨酸-组氨酸-谷氨酸脂肪酶的活性中心经常理在分子内部，被疏水的环境包围一个螺旋形的多肽结构作为遮盖物，使得酶的活性中心不易被溶剂和底物接近脂肪酶具有溶解蛋白的能力，这个螺旋形多肽结构也保护脂肪酶本身免受破坏Uppenberg 等用 X-射线研究了来自antarctica 假丝酵母的脂肪酶，证明了遮蔽丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸活动中心的螺旋形盖状结构的存在，界面活化现象可以激发盖状结构的开启，从而使活性中心暴露出来二、水和有机反应介质对脂肪酸的作用2.1 水对脂肪酶的作用 底物一般不溶于水，在水相系统的反应产率比较低Iwai 等在水溶液中使用来自 niger曲霉，delemar 根霉，白地霉和 cy-cfopium 青霉的脂肪酶催化一系列脂肪酸和萜烯醇（香叶醇和法呢醇）的酷化反应，转化率比较低，最高只可达到 45％，而 niger 曲霉脂肪酶基本没有催化活性。

但是，水有助于保持脂肪酶结构的完整性活性中心的极性和酶蛋白的稳定性水可以使得酶分子上的极性残基之间发生疏水相互作用，否则这些极性残基之间会相互结合，使酶失活脂肪酶的来源不同，在催化过程中需要的水的数量也差异很大 2.2 有机反应介质对脂肪酶的作用 脂肪酶的天然构型在非水溶剂的中变化较小，例如：猪胰腺脂肪酸在有机介质中，活性可以在 100℃保持好几个小时，在无水的或者接近天水的溶剂中，可以观察到脂肪酶的活性提高，底物特异性得到改进，对映体选择性也改善 有机溶剂保持一个较低的水分活度，可以降低酯化和水解反应的热动力学和动力学障碍，另外，有机底物在有机溶剂中较高的溶解度可以提高反应速度，非水体系中的高转化率也简化了分离工艺，脂肪酸在有机溶剂中的溶解度较低，通过在载体上逐步的解吸附作用可以减少酶的损失若使用低沸点的有机溶剂，最后的产物分离工艺可以进一步得到简化 有机反应介质与水的关系对反应的影响在非水反应介质中，与脂肪酶结合的水可能是体系中唯一的水，有机溶剂通过直接与酶相互作用或者脱去酶表面的水来影响反应如果在酶周围的水分较多，超过在酶表面形成一个完整水化层所需水量，这在一定程度上可以保护酶免受有机溶剂导致的失活，但是，多出的水分会影响底物的传质，特别是对于疏水性底物。

脂肪酶分子在无水有机溶剂中的结构比较僵直，不能保证必需的构型变化以给底物在活性中心上提供位置，导致酶的催化活性的下降，Gray 研究发现在无水情况下，圆筒状假丝酵母脂肪酶催化的酯交换反应生产丁酸薄荷酯的时候，反应在 24 小时后会停止，但是，每500 活力单位的脂肪酶添加 0.l 毫升水就可以把酶活性保持到 48 小时 水可以作为放松未折叠和重复折叠的酶分子的润滑剂，但这在恶劣环境条件下会导致酶的失活因此，在溶剂中的水量应该适当，这对确保高的催化活性是关键的总的说来，在非水酶学研究中，最好使用与水不混溶的疏水的有机溶剂水量刚刚低于水与溶剂的饱和界限的时候，是确保催化活性的最佳水量酶的活性是有机溶剂的疏水性有关，通过测定有机溶剂的疏水性可以预测有机溶剂是否适合做反应介质，参数一般是 logPoct，定义为一种溶剂在辛醇/水混合物中的分配系数的对数当 logPoct在 0.5－2 之间，logP oct与酶活性的关系不明确在 logPoct等于 1.63 的无溶剂中进行直接酯化可以得到满意的收率Claon 和 AKoh 报道说，在 logPoct大于等于 0.85 的有机溶剂中，酯化反应合成香茅醇醋酸酯的转化率可达 98％。

在高 logPcot范围内，随着有机溶剂logPcot增加，酶的活性没有呈现出相同的增加趋势三、酶在非水介质中的催化反应具有在许多常规水溶液中所没有的新特征和优势①可进行水不溶或水溶性差化合物的催化转化，大大拓展了酶催化作用的底物和生成产物的范围；②改变了催化反应的平衡点，使在水溶液中不能或很难发生的反应 向期望的方向得以顺利进行，如在水溶液中催化水解反应的酶在非水介质中可有效催化合成反应的进行；③使酶对包括区域专一性和对映体专一性在内的底物专一性大为提高，使对酶催化作用的选择性的有目的的调控的实现成为可能；④大大提高了一些酶的热稳定性；⑤由于酶不溶于大多数的有机溶剂，使催化后酶易于回收和重复利用；⑥可有效减少或防止由水引起的副反应的产生；⑦可避免杂水溶液中进行长期反应时微生物引起的污染；⑧可方便地利用对水分敏感的底物进行相关的反应；⑨当使用挥发性溶剂作为介质时，可使反应后的分离过程能耗降低四、有机溶剂的性质及其对酶催化的影响 有机溶剂是有机介质反应体系中的主要成分之～常用的有机溶剂有辛烷、正己烷、苯、吡啶、季丁醇、丙醇、乙腈、二氯甲烷等如前所述，有机溶剂中的酶催化反应有许多优点哗然而，在某些情况下，有机溶剂会导致酶变性或抑制酶的活性。

因此，在为某一反应体系选择溶剂时应考虑如下因素：底物和产物在其中的溶解度；溶剂的惰性、溶剂的挥发性、毒性、反应的后处理以及成本等酶具有完整的空间结构和活性中心才能发挥其催化功能在水溶液中，酶分子(固定化酶除外)均一地溶解于水溶液中，可以较好地保持其完整的空间结构在有机溶剂中，酶分子(经过修饰后可溶于有机溶剂者除外)不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应根据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持其空间结构完整性的情况也有所差别有些酶在有机溶剂的作用下，其空间结构会受到破坏，从而使酶的催化活性受到影响甚至引起酶的变性失活例如，碱性磷酸酶冻干粉悬浮于乙腈中20h，60％以上的酶不可逆地变性失活；悬浮于丙酮中36h，75％以上的酶呈现不可逆失活等此外，要使酶悬浮于有机介质中进行催化反应，通常要将酶进行冷冻干燥研究表明，酶分子冷冻干燥过程中，也往往会使酶的活性中心构象受到破坏，随意在酶的冷冻干燥过程中，应当加进蔗糖、甘露醇等冷冻干燥保护剂，以减少酶的变性失活有些酶，如脂肪酶、蛋白酶、多酚氧化酶等，在有机溶剂中其整体结构和活性中心基本上保持完整，能够在适当的有机介质中进行催化反应，然而也可能对酶的表面结构和活性中心产生一定的影响。

人们一直试图找到一个能够将酶的催化反应活性与溶剂的性质相关联的参数，然而至今没有一个单一的参数能够适用于所有的酶反应体系事实上某一反应体系最适溶剂的选择还是主要依赖于经验在众多关联酶活性和溶剂性质的参数中，最常用的就是溶剂的疏水性(极性)，表示为分配系数的对数，logP(P定义为某一溶剂在正辛醇，水相中的分配比例，即／>=[solvent]oetarlol／[solvent]ware，)Lanne等【4”提出了一条利用溶剂的lc}ge值预测酶活性的简单规则一般而言，酶在le·ge值4时反应活性中等；lcIge>4时反应活性较高Larme等【4副认为，亲水性的溶剂的溶剂化作用较强，能够剥离维持酶活性的必需水；疏水性的溶剂不能产生强烈的溶剂化作用，因而酶结合的必需水得以维持另外，有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应酶在有机介质中进行催化反应，其作用底物首先必须进入必需水层，然后才能进入酶的活性中心进行催化反应反应后生成的产物也首先分布在必需水层中，然后才从必需水层转移到有机溶剂中产物必需移出必需水层，酶催化反应才能继续进行下去有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。

如果有机溶剂的极性很小，疏水性太强，则疏水性底物虽然在有机溶剂中溶解度大，浓度高，但难于从有机溶剂中进入必需水层，与酶分子活性中心结合的底物浓度较低，而降低酶的催化速度；如果有机溶剂的极性过大，亲水性太强，则疏水性底物在有机溶剂中的溶解度低，底物浓度降低，也是催化速度减慢所以应该选择极性适中的有机溶剂作为介质使用有机溶剂对不同的酶和不同的反应有不同的影响因此，作为催化介质使用的有机溶剂必须通过实验进行选择、确定，这也是“溶剂工程(Solvent Engineering)”的重要任务。