(完整版)农业大学动物医学兽医格式新城疫RTPCR检测和毕业论文.doc
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安徽农业大学毕业论文题 目：新城疫 RT-PCR 检测和部分基因序列测定姓 名： 老男孩学 院： 动物医学院专 业： 兽医班 级： 2009级9班学 号：指导教师： ++2013年 6月 8 日目 录 1Abstract 231 51 . 151 . 251 . 31 . 4 R T - P C R551 . 4 . 151 . 4 . 251 . 4 . 3 N D V61 . 5 N D V61 . 5 . 1 N D V61 . 5 . 2 N D V71 . 5 . 3 R T - P C R71 . 5 . 481 . 5 . 581 . 5 . 68282.1 RT - PCR 82. 2 NDV RT- PCR92.3 NDV 103 . 0 114 . 0 1415 16新城疫 RT-PCR 检测和部分基因序列测定 ++摘要： 应用已经建立的新城疫病毒RT-PCR快速诊断技术，对由德国卡塞蒂非生物工程有限公司提供的疑似新城疫病毒感染的禽病料进行了检测，检测结果为阳性。
并对检测结果为阳性的病料进行鸡胚传代，对病毒进行增殖 从鸡胚尿囊液中通过提核酸，反转录， PCR 扩增分别扩增出 2 段基因片段，用 1%琼脂糖胶电泳分析 RT-PCR产物，构建重组表达载体，转化宿主菌，然后送由姜成康新有限公司进行基因测序序列分析显示所扩增的目的基因片段长度是 2808bp 和 960bp，序列测定结果已经登陆到 GenBank ，登陆号为 EU546165.2 通过 GenBank 的 Blast 比对其与 JL-1 和 LaSota 株同源性相近，从部分序列上来看属于 Class II genotype II 关键词： 新城疫； RT-PCR ；临床诊断；基因测序；RT-PCR Detection of ND and Part GeneSequence Analysis of NDVStudent Majoring in Veterinary medicine laonanhaiTutor ++Abstract ： The rapid differential diagnosis technique for detection of NDV wasused to detect a clinical sample provided by the Bioengineering Company. The positive sample was diagnosed by the gene sequencing. Extract nucleic acid from thechick embryo allantois. Through reverse transcription and PCR, two gene segments are amplified respectively. Conduct the electrophoretic analysis of RT-PCR outcomeby using the agarose gel of 1%. Construct and recombine the expression vector, transform it to the send to Biotechnology to conduct the genetic sequencing. Comparison of sequencing results with the NCBI database found that these two genefragments showed no significant variation. All the sequences obtained from the NDVisolates were submitted to GenBank ， the accession numbers were EU546165.2 ． Thesequence analysis showed that the length of the gene segments amplified were 2808bp and 960bp ． It is ，以 12000rmin 离心 10min，取离心后上清 600μl，再加异丙醇 800μl，颠倒混匀之后，放置于 -20℃的环境条件下沉淀 30min，以 12000rmin 离心 10min，管盖的尾部要求必须朝向一致，要求向外，避免溶核算时核酸的丢失。
倾倒掉上清，将管口向下倒置于先前准备好的吸水纸上停留 5-10S，沿离心管的管壁加入 1000μl的 75% 冷乙醇（-20℃保存）冲洗 1-2 次，低速离心之后，将微量移液器的枪头置于核酸相反的位置用微量移液器吸出残余的液体，每个离心管吸取操作前必须换一个枪头 反转录反转录体系为：注射用水11μl5×PCR Buffer （Mg2+ free）4.0μldNTP （10mmolL）2.0μl反转录酶 M-MLV （200Uμl）1.0μl酶抑制剂（ Inhibiter ）0.5μl引物 A（ 25pmolμl）0.75μl引物 B（ 25pmolμl）0.75μl按以上试剂量配制 20μl体系并震荡，低速离心混匀或用振荡器混匀，体系溶解核酸，低速离心后将体系放入 42℃水浴锅内进行反转录 1h1.4.3 扩增 NDV 部分基因片段PCR 扩增体系为：注射用水17μl10×PCR Buffer （Mg2+ free）3.0μldNTP （2.5mmolL）2.0μlMgCl2 （ 25mmolL）4μlrTaq DNA Polymerase（ 5Uμl）0.5μl引物 A（ 25pmolμl）0.5μl引物 B（ 25pmolμl）0.5μl反应条件为： 94℃条件下预变性 5min；94℃条件下变性 30S，55℃条件下退火 40S，72℃条件下延伸 1min30S，进行 30 个循环； 72℃条件下终延伸 10min。
将 28μl体系加入 Eppendorf 管（ 200μl），加反转录产物 2μl 于管内并吹打， 低速离心后放于 PCR 仪内进行扩增 用 1% 琼脂糖胶电泳分析 RT-PCR 产物1.5 NDV 部分基因片段序列测定 NDV 的增殖将研磨的鸡病料在 -20℃环境下反复冻融 3 次，取病料上清按一定浓度稀释后接种到 SPF 鸡胚尿囊腔内孵育 48-72h, 收获鸡胚尿囊液 , 测定血凝效价取鸡胚尿囊液做血凝和血凝抑制试验检测病毒滴度 NDV 部分基因片段扩增取 400μl的鸡胚尿囊液加 600μl的裂解液，颠倒混匀大约 10 次后，加400μl的氯仿， 加氯仿前先吹打几次， 颠倒混匀大约 10 次后，置于 -20℃环境条件下沉淀 10min，以 12000rmin 的转速离心 10min，取上清 600μl，加异丙醇 800μl，颠倒混匀后大约 10 次后，放置 -20℃的环境条件下沉淀30min，以 12000rmin 的转速离心 10min，要求管盖尾部必须朝向一致，要求一致向外，避免溶核算时发生核酸丢失倾倒去上清，将管口向下倒置于吸水纸上停留约 5-10S，沿离心管内侧壁加入 1000μl的 75% 冷乙醇（ -20℃保存）冲洗 1-2 次，低速离心之后，将微量移液器的枪头置于核酸相反的位置用微量移液器吸出管内残余液体，每个离心管必须更换一个枪头。
按照新城疫 RT-PCR 检测中的步骤进行反转录和 PCR 扩增通过使用特异性引物扩增新城疫不同基因片段 用 1% 琼脂糖胶电泳分析 RT-PCR产物，并拍照记录电泳图片 回收纯化 RT-PCR 产物具体操作按 Biospin胶回收试剂盒说明书进行，步骤如下：1) 用锋利、干净的手术刀，将包含有目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶切下，并放进 1.5 或 2.0ml 离心管中，称重2) 按照 1：3 的比例（凝胶质量的毫克数：融胶液体积的微升数）向离心管内加入 Extraction Buffer3) 于恒温金属浴或水浴中温育 50℃，直到凝胶全部融化4) 可选：按 1： 1 的比例（凝胶质量的毫克数：异丙醇的体积的微升数）加异丙醇，然后混匀5) 将离心管内的所有混合液移入 Spin column内，于 6000g 离心 1min，然后丢弃接液管里的液体6) 向 Spin column内加入 500μl Extraction Buffer，于 12000g离心约 30-60秒，并丢弃接液管里的液体7) 向 Spin column 内加 750μl的 Wash Buffer，于 12000g 离心约 30-60秒，然后丢弃接液管里的液体。
8) 再在 12000g离心 1min，并将 Spin column转入无菌的 1.5ml 离心管里9) 向 Spin column中加入 50μl的 Elution Buffer、水或 TE 溶液，在室温放置 1 分钟10) 在 12000g离心 1min，在微量离心管的溶液内就包含目的 DNA 基因片段 构建重组表达质粒酶切回收的目的基因片段，并与表达载体用连接酶连接整个操作过程均在冰浴上进行 将连接体系混匀之后放置于 16℃恒温水浴环境中反应8h 即可用于转化 制备感受态细胞用。
