第3章-植物组织培养与细胞...ppt

第第3 3章章 植物组织培养与细胞培养植物组织培养与细胞培养东北大学生物技术研究所东北大学生物技术研究所3.3 3.3 植物组织与器官培养植物组织与器官培养3.3.1 3.3.1 植物组织培养的定义与分类植物组织培养的定义与分类3.3.2 3.3.2 重要概念重要概念3.3.3 3.3.3 细胞分化和形态建成细胞分化和形态建成3.3.4 3.3.4 植物组织培养的基本步骤植物组织培养的基本步骤3.3.5 3.3.5 植物组织器官培养植物组织器官培养3.3.6 3.3.6 植物组织培养的应用植物组织培养的应用3.3.7 3.3.7 人工种子人工种子3.3.8 3.3.8 植物组织与器官的生物反应器培养植物组织与器官的生物反应器培养3.3.9 3.3.9 植物组织与器官培养存在的问题植物组织与器官培养存在的问题3.3.1 3.3.1 植物组织培养的定义与分类植物组织培养的定义与分类1.1.定义定义 植物组织培养植物组织培养(plant tissue culture)(plant tissue culture)是指在无是指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等）、组织（如花药组织、花、未成熟的果实、种子等）、组织（如花药组织、胚乳、皮层等）、胚胎（如成熟和未成熟的胚）、原胚乳、皮层等）、胚胎（如成熟和未成熟的胚）、原生质体等培养在人工配制的培养基上，给予适当的培生质体等培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整植株的一种实验技术。

完整植株的一种实验技术其理论基础是细胞的全能其理论基础是细胞的全能性 2.2.分类分类§根据根据外植体种类外植体种类的不同的不同，组织培养可分为：，组织培养可分为：器官培养、器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等§根据根据培养方法培养方法的不同，的不同，组织培养可分为：组织培养可分为：微室培养、平微室培养、平板培养、悬浮培养、液体培养、固体培养等板培养、悬浮培养、液体培养、固体培养等§根据根据培养的功能性培养的功能性的不同，组织培养可分为：的不同，组织培养可分为：再生体系、再生体系、离体受精、突变体选择、体细胞杂交等离体受精、突变体选择、体细胞杂交等3.3.2 3.3.2 重要概念重要概念• 全能细胞（全能细胞（totipotenttotipotent cell) cell)• 愈伤组织愈伤组织 (callus)(callus)• 外植体外植体 ( (explantationexplantation) )• 继代培养继代培养 (secondary culture)(secondary culture)• 胚胎培养胚胎培养 (embryo culture)(embryo culture)• 脱分化（脱分化（dedifferentiation dedifferentiation ））• 再分化（再分化（redifferentiationredifferentiation) )• 茎尖培养茎尖培养• 无性繁殖系无性繁殖系 (clone)(clone)• 器官发生器官发生（（organogenesis)organogenesis)• 胚状体胚状体（（embryoidembryoid) )• 全能细胞（全能细胞（totipotenttotipotent cell) cell)：：能够表达生物体基因组的任能够表达生物体基因组的任何一种基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞，进而发育何一种基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞，进而发育为一个完全相同生物体。

为一个完全相同生物体• 愈伤组织愈伤组织( (callus)callus)：：在离体培养过程中由外植体组织增生的细在离体培养过程中由外植体组织增生的细胞产生的具有分生能力的一团不规则的疏散排列的薄壁细胞胞产生的具有分生能力的一团不规则的疏散排列的薄壁细胞• 外植体外植体( (explantexplant) )：：从植物体上分离下来的用于离体培养的材从植物体上分离下来的用于离体培养的材料，可以是器官、组织和原生质体等料，可以是器官、组织和原生质体等• 继代培养继代培养( (secondary culture)secondary culture)：：更换新鲜培养基来繁殖同更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织种类型的材料（愈伤组织. .芽等）• 胚胎培养胚胎培养( (embryo culture):embryo culture):包括原胚和成熟胚培养、胚乳培包括原胚和成熟胚培养、胚乳培养、胚珠和子房养、胚珠和子房( (未授粉或已授粉的未授粉或已授粉的) )培养，可用于研究胚胎发生以及培养，可用于研究胚胎发生以及影响胚生长的因素；用试管受精或幼胚培养可获得种间或属间远缘杂影响胚生长的因素；用试管受精或幼胚培养可获得种间或属间远缘杂种，因此它也是研究生殖生理的有用方法；胚乳培养是研究胚乳的功种，因此它也是研究生殖生理的有用方法；胚乳培养是研究胚乳的功能、胚乳与胚的关系，以及获得三倍体植株的一个手段。

能、胚乳与胚的关系，以及获得三倍体植株的一个手段• 脱分化（脱分化（dedifferentiation dedifferentiation ））: :已分化好的细胞在人工诱已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程• 再分化（再分化（redifferentiationredifferentiation):):脱分化后具有分生能力的细脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程• 茎尖培养茎尖培养: :较小的仅带几个叶原基或少量幼叶的茎端部分的培养较小的仅带几个叶原基或少量幼叶的茎端部分的培养通常用通常用1 1—1010mmmm大小的外植体来加速植物的无性系繁殖大小的外植体来加速植物的无性系繁殖• 无性繁殖系无性繁殖系( (clone)clone)：：由同一个外植体反复进行继代培养后所由同一个外植体反复进行继代培养后所得一系列的无性繁殖后代得一系列的无性繁殖后代• 器官发生（器官发生（organogenesisorganogenesis) )：：在组织培养中或悬浮培养中，在组织培养中或悬浮培养中，由培养物到显示有自然的器官形成，如形成芽或根的现象。

由培养物到显示有自然的器官形成，如形成芽或根的现象• 胚状体（胚状体（embryoidembryoid) )：：在离体培养过程中产生一种形似胚（具在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构3.3.3 3.3.3 植物细胞分化和形态建成植物细胞分化和形态建成•一般植物通过细胞或组织培养达到再生目的要经过两个一般植物通过细胞或组织培养达到再生目的要经过两个步骤：步骤： (1) (1) 培养的植物细胞或组织的脱分化，形成愈伤组织；培养的植物细胞或组织的脱分化，形成愈伤组织； (2) (2) 有新形成的愈伤组织形成一些分生细胞团，随后又有新形成的愈伤组织形成一些分生细胞团，随后又由其分化成不同的器官原基（如根原基、叶原基等）由其分化成不同的器官原基（如根原基、叶原基等）• 脱分化后的细胞进行再分化的过程有两种不同的方式：脱分化后的细胞进行再分化的过程有两种不同的方式： （（1 1）器官发生方式：其中芽和根在愈伤组织的不同部位分别独立形成，）器官发生方式：其中芽和根在愈伤组织的不同部位分别独立形成，具有单极性结构。

具有单极性结构 （（2 2）胚胎发生方式：在愈伤组织表面或内部形成很多）胚胎发生方式：在愈伤组织表面或内部形成很多胚状体胚状体，它们类，它们类似于合子胚，具有双极性结构似于合子胚，具有双极性结构魔魔芋芋胚胚状状体体•通过胚状体途径产生再生植株有通过胚状体途径产生再生植株有3 3个显著优点：个显著优点： （（1 1）在一个培养物上所能产生的胚状体数目往往比不定）在一个培养物上所能产生的胚状体数目往往比不定芽数目多；芽数目多； （（2 2）胚状体形成的速度快；）胚状体形成的速度快； （（3 3）胚状体结构完整，一旦形成，一般都可以直接萌发）胚状体结构完整，一旦形成，一般都可以直接萌发形成小植株，因此成苗率高形成小植株，因此成苗率高3.3.4 3.3.4 植物组织培养的基本步骤植物组织培养的基本步骤以胡萝卜为例，介绍植物组织培养的一般过程以胡萝卜为例，介绍植物组织培养的一般过程（（图解图解）：）：（（1 1））培养材料的采集培养材料的采集（（2 2））培养材料的消毒培养材料的消毒（（3 3））制备外植体制备外植体（（4) 4) 接种和培养接种和培养（（5 5））组培苗的练苗和移栽组培苗的练苗和移栽花药培养花药培养单倍体细胞和胚单倍体细胞和胚状体状体细胞和集合体细胞和集合体悬浮培养悬浮培养球形球形形成胚状体形成胚状体心形期心形期鱼雷期鱼雷期子叶期子叶期外植体外植体外植体在培养中直接振荡外植体在培养中直接振荡在培养液中振荡在培养液中振荡在生长素在生长素-营养物营养物琼脂培养基上生琼脂培养基上生长的愈伤组织长的愈伤组织植物组织培养的一般过程的完整周期图解植物组织培养的一般过程的完整周期图解（（1 1）培养材料的采集）培养材料的采集n组织培养所用的材料非常广泛，可采取根、茎、叶、组织培养所用的材料非常广泛，可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其中中根尖根尖不易灭菌，一般很少采用。

不易灭菌，一般很少采用  n对于对于木本花卉木本花卉来说，阔叶树可在来说，阔叶树可在一、二年生一、二年生的枝条上的枝条上采集，采集，针叶树种针叶树种多采种子内的多采种子内的子叶或胚轴草本植物子叶或胚轴草本植物多采集多采集茎尖茎尖  n在快速繁殖中，最常用的培养材料是茎尖，通常切块在快速繁殖中，最常用的培养材料是茎尖，通常切块在在0.50.5厘米厘米左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.10.1毫毫米以下米以下  （（2 2）培养材料的消毒）培养材料的消毒n先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块毒刀片切成小块  n在无菌坏境中将材料放入在无菌坏境中将材料放入7070％％酒精中浸泡酒精中浸泡3030－－6060秒  n再将材料移入漂白粉的再将材料移入漂白粉的饱和液饱和液或或0.010.01％％升汞水中消毒升汞水中消毒1010分钟。

分钟  n取出后用无菌水冲洗三、四次取出后用无菌水冲洗三、四次  （（3 3）制备外植体）制备外植体n将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮然后切成片则不需剥皮然后切成0.20.2－－0.50.5厘米厚的小片，这厘米厚的小片，这就是外植体在操作中严禁用手触动材料就是外植体在操作中严禁用手触动材料    （（4) 4) 接种和培养接种和培养n接种：接种：　　  在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种每瓶接种4 4－－1010个  n封口：封口：　　  接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口胶带封口  n温度：　温度：　  培养基大多应保持在培养基大多应保持在25℃25℃左右，但要因花卉种类及材左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待料部位的不同而区别对待  n增殖：　增殖：　  外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。

把材料分株或切段转入增殖培了扩大繁殖系数，需要继代培养把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高增殖率的提高增殖1 1个月左右后，可视情况进行再增殖个月左右后，可视情况进行再增殖  n根的诱导：根的诱导：　　  继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养须转到生根培养基上进行生根培养1 1个月后即可获得健壮根系个月后即可获得健壮根系  （（5 5）组培苗的练苗和移栽）组培苗的练苗和移栽n试试管管苗苗从从无无菌菌以以及及光光照照、、温温度度、、湿湿度度稳稳定定的的环环境境进进入入自自然环境，必须进行炼苗然环境，必须进行炼苗n一一般般移移植植前前，，先先将将培培养养容容器器打打开开，，于于室室内内自自然然光光照照下下放放3 3天天，，然然后后取取出出小小苗苗，，用用自自来来水水把把根根系系上上的的营营养养基基冲冲洗洗干干净净，，再再栽栽入入已已准准备备好好的的基基质质中中，，基基质质使使用用前前最最好好消消毒毒移移栽栽前前要要适适当当遮遮荫荫，，加加强强水水分分管管理理，，保保持持较较高高的的空空气气湿湿度度（相对湿度（相对湿度9898％左右），但基质不宜过湿，以防烂苗％左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。

这是这是哪个哪个阶段阶段？？这是这是哪个哪个阶段阶段？？植植物物组组织织培培养养流流程程图图3.3.5 3.3.5 植物组织器官培养植物组织器官培养n1.1.定义定义 植物组织器官培养植物组织器官培养就是在植物细胞全能就是在植物细胞全能性理论指导下，在组织以及器官水平上开展研性理论指导下，在组织以及器官水平上开展研究的，其目的是实现植物细胞的全能性以完成究的，其目的是实现植物细胞的全能性以完成植物生命周期的过程植物生命周期的过程2. 2. 愈伤组织诱导愈伤组织诱导（（1) 1) 愈伤组织形成特点愈伤组织形成特点 由外植体或单个细胞形成愈伤组织一般要经过由外植体或单个细胞形成愈伤组织一般要经过3 3个步骤：个步骤：v 启动期（或诱导期）启动期（或诱导期）v 分裂期分裂期v 分化期分化期 启动期（或诱导期）启动期（或诱导期）: :是成熟组织在各种刺激因是成熟组织在各种刺激因素的诱导作用下细胞内蛋白质及核酸的合成代谢迅素的诱导作用下细胞内蛋白质及核酸的合成代谢迅速加强的过程受激作用后分裂前细胞的主要变化速加强的过程。

受激作用后分裂前细胞的主要变化有：有：一是呼吸作用加强，消耗氧量明显增加；二是一是呼吸作用加强，消耗氧量明显增加；二是多聚核糖体的不断增加，到有丝分裂前多聚核糖体的不断增加，到有丝分裂前RNARNA的含量可的含量可增加增加300%300%；三是蛋白质合成加快，分裂前细胞内蛋；三是蛋白质合成加快，分裂前细胞内蛋白质的总量增加白质的总量增加200%200%；四是各种与分裂有关的酶活；四是各种与分裂有关的酶活性大大加强性大大加强分裂期：分裂期：其主要特征是：细胞数目增加很大，结构疏松，其主要特征是：细胞数目增加很大，结构疏松，缺少有组织特征的结构，一般呈现透明状或浅颜色缺少有组织特征的结构，一般呈现透明状或浅颜色分化期：分化期：停止分裂的细胞发生生理代谢方面的变化，出停止分裂的细胞发生生理代谢方面的变化，出现了形态和生理功能上的分化，直至出现了分生组织的现了形态和生理功能上的分化，直至出现了分生组织的瘤状结构及维管组织此时，细胞体积不再减小，呈现瘤状结构及维管组织此时，细胞体积不再减小，呈现的颜色多种多样的颜色多种多样（（2 2）愈伤组织的生长及分化）愈伤组织的生长及分化（（3 3）影响愈伤组织培养的主要因素）影响愈伤组织培养的主要因素v 外植体外植体: :虽然所有植物都有被诱导产生愈伤组织的虽然所有植物都有被诱导产生愈伤组织的潜在能力，但是不同的植物种类诱导形成愈伤组织的潜在能力，但是不同的植物种类诱导形成愈伤组织的难易程度差别很大。

难易程度差别很大v 基本培养基：基本培养基：众多的培养基基本上都可以诱导出愈众多的培养基基本上都可以诱导出愈伤组织，但不同的植物种类、基因型和外植体诱导形伤组织，但不同的植物种类、基因型和外植体诱导形成愈伤组织的难易程度不同，对培养基的反应也有差成愈伤组织的难易程度不同，对培养基的反应也有差别v 激素组合：激素组合：通常高浓度的生长素和低浓度的激动素通常高浓度的生长素和低浓度的激动素有利于愈伤组织的诱导和增殖其中，有利于愈伤组织的诱导和增殖其中，2,4-2,4-D D是诱导是诱导愈伤组织最有效的物质愈伤组织最有效的物质3.3.举例举例以番杏的组织培养为例介绍组织器官培养技术：以番杏的组织培养为例介绍组织器官培养技术： 番杏别名洋菠菜，属番杏科番杏属的多年生草本植物主要以肥番杏别名洋菠菜，属番杏科番杏属的多年生草本植物主要以肥厚多汁的嫩茎叶作蔬菜食用，并可全株入药，有凉血、解毒、利尿、厚多汁的嫩茎叶作蔬菜食用，并可全株入药，有凉血、解毒、利尿、消疮疥等的功效消疮疥等的功效具体方法如下：具体方法如下：（（1 1））材料和培养基：材料和培养基：番杏果实和幼苗；番杏果实和幼苗；(1(1））芽分化培养基：芽分化培养基：MS+6-MS+6-BA1.0mg/LBA1.0mg/L（（单位下同）单位下同）+ +NAA0.1+3.0%NAA0.1+3.0%蔗糖蔗糖; ;(2(2））诱导愈伤组织与分化诱导愈伤组织与分化培养基：培养基：MS+6-BA 1.0+2,4-D 0.5+3.0%MS+6-BA 1.0+2,4-D 0.5+3.0%蔗糖蔗糖; ;(3(3））生根培养基：生根培养基：3/43/4MS+NAA0.1+1.5%MS+NAA0.1+1.5%蔗糖蔗糖; ;(4(4））继代培养基：继代培养基：MSMS培养基。

以上各培养基培养基以上各培养基加加0.7%0.7%琼脂，琼脂，PH5.8PH5.82 2））培养条件：培养条件：培养温度培养温度25℃25℃左右，日光灯照明，每天光照左右，日光灯照明，每天光照1010h, h, 光光照强度照强度1000~15001000~1500lxlx（（3 3））无菌苗的获取：无菌苗的获取：将番杏果实在浓硫酸中浸泡约将番杏果实在浓硫酸中浸泡约1 1h h，，流水流水冲洗冲洗3030minmin再在超净工作台再在超净工作台（（图示图示）内用）内用70%70%乙醇浸泡乙醇浸泡2-2-3 3minmin，，在无菌滤纸上吸干或酒精灯焰烧干，再用在无菌滤纸上吸干或酒精灯焰烧干，再用0.1%0.1%升汞浸升汞浸泡泡1010min, min, 无菌水冲洗无菌水冲洗3-43-4次次, , 用无菌手术刀轻轻刮去果实被用无菌手术刀轻轻刮去果实被腐蚀的部分，然后将其接种于培养基腐蚀的部分，然后将其接种于培养基（（3 3））中，培养中，培养1 1周后种周后种子长出无菌苗（子长出无菌苗（图示图示）4 4））愈伤组织培养：愈伤组织培养：切取切取0.50.5cmcm长的不带腋芽的茎段，置于长的不带腋芽的茎段，置于（（2 2））号培养基上。

号培养基上3 3周后，茎段周围出现白色松脆的愈伤组周后，茎段周围出现白色松脆的愈伤组织（织（图示图示）愈伤组织的形成标志着接种外植体的生长状态）愈伤组织的形成标志着接种外植体的生长状态已脱离分化状态，开始重新恢复已脱离分化状态，开始重新恢复分生能力分生能力超净工作台番杏无菌苗番杏愈伤组织（（5 5））继代培养：继代培养：将愈伤组织在无菌条件下从试管中取出，用无将愈伤组织在无菌条件下从试管中取出，用无菌水洗净，以镊子和解剖刀剔除附着在愈伤块上的培养基，并菌水洗净，以镊子和解剖刀剔除附着在愈伤块上的培养基，并用无菌水反复冲洗数次，直至愈伤块上无残留培养基为止用用无菌水反复冲洗数次，直至愈伤块上无残留培养基为止用解剖刀将愈伤块切成数小块，在接种到装有愈伤组织诱导培养解剖刀将愈伤块切成数小块，在接种到装有愈伤组织诱导培养基的三角瓶中，再与诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养基的三角瓶中，再与诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养几天后，三角瓶中的小愈伤块即可逐渐长大，这一过程称作继几天后，三角瓶中的小愈伤块即可逐渐长大，这一过程称作继代培养通过愈伤组织的继代培养，原来接种的代培养通过愈伤组织的继代培养，原来接种的1 1个番杏茎段组个番杏茎段组织可繁殖出大量的新接种材料用于分化培养。

织可繁殖出大量的新接种材料用于分化培养6 6））分化培养：分化培养：剥离白色松脆的愈伤组织继续置于剥离白色松脆的愈伤组织继续置于（（2 2））号培号培养基上，养基上，2 2月后，部分白色愈伤组织上出现绿色芽点（月后，部分白色愈伤组织上出现绿色芽点（图示图示）随着时间推移，绿色芽点不断膨大，其中部分形成正常绿苗随着时间推移，绿色芽点不断膨大，其中部分形成正常绿苗（（图示图示）带绿色芽点的愈伤组织番杏分化绿苗番杏盆栽苗番杏无菌苗（（7 7））生根培养：生根培养：剥离绿苗接种到剥离绿苗接种到（（3 3））号培养基上诱导生根号培养基上诱导生根（（图示图示）7 7d d后开始陆续出根，后开始陆续出根，3 3周后可有多条须根形成，周后可有多条须根形成，生根率达生根率达95.7%95.7%8 8））炼苗与移栽：炼苗与移栽：移栽前，敞瓶炼苗移栽前，敞瓶炼苗3-43-4d d，，取出洗净后，取出洗净后，栽至装有蛭石的塑料杯中，加自来水，杯上罩上玻璃烧杯保栽至装有蛭石的塑料杯中，加自来水，杯上罩上玻璃烧杯保湿，湿，4 4d d后昼覆夜敞，后昼覆夜敞，2 2周后可除掉玻璃杯周后可除掉玻璃杯3 3周后，试管苗张周后，试管苗张出新根，再将其移入蛭石与土（出新根，再将其移入蛭石与土（2 2：：1 1）的盆（）的盆（图示图示）中。

成）中成活率为活率为83.3%83.3%3.3.6 3.3.6 植物组织培养的应用植物组织培养的应用1. 1. 无性系快速繁殖技术无性系快速繁殖技术2. 2. 获得无病毒植株获得无病毒植株3. 3. 新品种培育新品种培育4. 4. 在遗传、生理生化和病理等研究上的应用在遗传、生理生化和病理等研究上的应用5. 5. 种质资源的保种质资源的保存存6. 6. 产业化生产前景产业化生产前景 1. 1. 无性系快速繁殖技术无性系快速繁殖技术n对对那那些些繁繁殖殖系系数数低低或或很很难难用用种种子子繁繁殖殖的的名名特特珍珍品品种种的的繁繁殖殖实实用用意意义义更更大大, ,甚甚至至是是无无可可取取代代如如脱脱毒毒苗苗、、新新育育成成、、新新引引进进、、稀稀缺缺育育种种、、优优良良单单株株、、濒濒危危植植物物和和基基因因工工程程植植株株等等可可通通过过离离体体快快速速繁繁殖殖, ,以以比比常常规规育育苗苗方方法法快快数数百百倍倍到到数数万万倍倍的的速速度度扩扩大大繁繁殖殖, ,及及时时提提供供大大量量优优质质种种苗苗如如野野生生珍珍稀稀兰兰花花属属国国家家二二级级以以上上保保护护植植物物, ,野野生生兰兰花花的的组组织织培培养养利利于于保护这些珍稀的植物资源。

保护这些珍稀的植物资源n目目前前, ,在在国国内内外外已已掀掀起起““试试管管苗苗””热热, ,如如国国外外在在兰兰花花、、杜杜鹃鹃、、月月季季、、草草莓莓、、苹苹果果、、柑柑桔桔、、石石竹竹、、铁铁线线莲莲、、桉桉树树等等进进行行快快速速繁繁殖殖已已达达到到商商品品化化生生产产; ;我我国国近近年年来来已已获获成成功功推推广广的的有有甘甘蔗蔗、、葡葡萄萄、、罗罗汉汉果果、、兰兰花花、、银银杏杏、、水水稻稻、、甘甘蔗蔗、、菠菠萝萝、、香香蕉蕉、、草草莓莓、、月月季季、、菊菊花花、、无无籽籽西西瓜瓜、、栎栎树树、、山山楂楂、、猕猕猴猴桃桃、、雪雪松松等等品品种种试试管管苗苗在在国国际际国国内内市市场场上上已已形形成成产产业业化化生生产产, ,如如广广西西都都安安县县山山葡葡萄萄苗苗、、罗罗城城县县毛毛葡葡萄萄苗苗均均由由国国内内组组织织培培养养公公司提供司提供, ,每年需要量达数十万株每年需要量达数十万株2. 2. 获得无病毒植株获得无病毒植株n很很多多农农作作物物都都带带有有病病毒毒, ,病病毒毒是是植植物物的的严严重重病病害害, ,至至2000 2000 年年, ,已已定定名名或或暂暂定定名名的的植植物物病病毒毒的的种种类类已已达达909 909 种种, ,极极难难防防治治。

如如防防治治无无方方, ,不不仅仅会会影影响响作作物物的的品品质质及及产产量量, ,严严重重的的只只能能拔拔除除病病株株, ,造造成成很很大大经经济济损损失失病病毒毒在在植植株株上上的的分分布布是是不不均均一一的的, ,病病毒毒是是通通过过维维管管系系统统及及胞胞间间连连丝丝移移动动的的, ,老老的的组组织织和和器器官官病病毒毒含含量量高高, ,幼幼嫩嫩未未成成熟熟的的组组织织和和器器官官病病毒毒含含量量较较低低, ,如如分分裂裂速速度度很很快快的的茎茎尖尖、、根根尖尖生生长长点点几几乎乎不不含含病病毒毒用用植植物物生生长长点点培培养养法法可可获获得得无无病病毒毒植植株株, ,恢恢复复植植物物的的优优良良品质品质, ,达到复壮的目的达到复壮的目的n目目前前已已在在广广西西荔荔蒲蒲芋芋、、永永福福罗罗汉汉果果、、桉桉树树、、马马铃铃薯薯、、甘甘薯薯、、百百合合、、兰花、大蒜、石竹、柑桔、草莓等植物品种上得到成功推广兰花、大蒜、石竹、柑桔、草莓等植物品种上得到成功推广3. 3. 新品种培育新品种培育n单单倍倍体体育育种种: :通通过过花花药药培培养养, ,从从小小孢孢子子获获得得单单倍倍体体植植株株, ,染染色色体体加加倍倍后后获获得得正正常常二二倍倍体体植植株株, ,这这是是一一条条育育种种的的新新途途径径。

单单倍倍体体育育种种可可以以缩缩短短育育种种年年限限, ,节节约约人人力力物物力力, ,较较快快地地获获得得优优良良品品种种, ,目目前前已已有有4040多多种种植植物物获获得得了了单单倍倍体体植植株株我我国国在在水水稻稻、、小小麦麦、、烟烟草草、、柏树、橡胶、辣椒等植物柏树、橡胶、辣椒等植物的单倍体育种的工作上的单倍体育种的工作上, ,处于领先地位处于领先地位n胚胚培培培培养养、、子子房房培培养养、、胚胚珠珠培培养养: :为为了了克克服服植植物物远远缘缘杂杂交交的的不不亲亲和和性性, ,可可采采用用胚胚、、子子房房、、胚胚珠珠培培养养和和试试管管受受精精等等手手段段使使胚胚正正常常发发育育并并成成功功地地培培养养出出杂杂交交后后代代现现在在已已在在棉棉花花、、玉玉米米、、黄黄麻麻等等品品种种上获得成功上获得成功4.4.在遗传、生理生化和病理等研究上的应用在遗传、生理生化和病理等研究上的应用n要要揭揭开开生生命命活活动动的的秘秘密密，，需需要要多多科科学学、、多多技技术术的的相相互互配配合合，，其其中中植植物物组组织织培培养养技技术术是是不不可可缺缺少少的的，，它它为为遗遗传传学学、、分分子子生生物物学学、、细细胞胞生生物物学学、、生生物物工工程程等等提提供供了了一一种种有有效效、、快快速速的的方方法法。

因因为为要要揭揭示示生生命命的的奥奥秘秘，，首首先先要要研研究究单单个个基基因因的的作作用用，，研研究究它它在在细细胞胞内内是是如如何何组组装装的的，，如如何何与与其其它它基基因因发发生生联联系系，，如如何何表表达达和和调调控控等等分分离离单单个个基基因因，，对对它它DNADNA进进行行测测序序，，再再对对其其中中的的某某些些碱碱基基实实行行突突变变，，然然后后还还需需要要将将基基因因送送到到受受体体细细胞胞当当中中，，看看表表达达情情况况，，以以确确定定其其功功能能接接受受基基因因的的受受体体细细胞胞要要产产生生再再生生植植株株，，就就需需要要通通过过组组织织培培养养的方法才能实现的方法才能实现 5. 5. 种质资源的保存种质资源的保存n传传统统上上, ,种种质质是是以以种种子子的的形形式式保保存存的的这这种种保保存存方方法法的的局局限限性性: : (1)(1) 种种子子生生活活力力随随贮贮存存时时间间的的延延长长生生活活力力逐逐渐渐下下降降, ,并并常常受受到到病病虫虫害害的的侵侵袭袭; ; (2)(2) 难难以以保保存存无无性性繁繁殖殖的的作作物物另另一一方方面面, ,如如用用苗苗圃圃或或田田间间大大量量保存各种植物基因型保存各种植物基因型, ,成本极高成本极高, ,还存在天灾毁灭的危险。

还存在天灾毁灭的危险n在在低低温温条条件件下下(- (- 20 20 ℃- ℃- - - 196 196 ℃)℃) , ,在在试试管管中中保保存存组组织织培培养养物物质质的的方方法法保保存存种种质质, ,具具有有传传统统方方法法不不可可比比拟拟的的优优点点: : (1)(1) 只只需需要要较较少少的的空空间间就就能能保保存存大大量量的的““营营养养体体种种子子””( ( vegetative vegetative seeds) seeds) ; ; (2)(2) 不不受受病病虫虫害害侵侵染染; ; (3)(3) 当当需需要要的的时时候候, ,可可把把所所贮贮存存的的材材料料用用作作核核心心原原种种迅迅速速繁繁殖殖出出大大量量植植株株; ; (4)(4) 由由于于不不带带已已知知的的病病毒毒和和病病原原菌菌, ,因因此此可可以以把把这这些些植植物物的的克克隆隆在在国国际际间间进进行行交交换换; ; (5)(5) 节节省省大大量量人人力力、、财财力力、、物物力力经经低低温温贮贮藏藏的的物物种种, ,保保持持了了稳稳定定的的遗遗传传性性和和良良好好的的存存活活率率据据报报导导, ,冷冷冻保存的胡萝卜胚状体冻保存的胡萝卜胚状体, ,在保存了在保存了1 1 年之后仍有再生成植株的能力。

年之后仍有再生成植株的能力6. 6. 产业化生产前景产业化生产前景n植植物物有有用用化化合合物物包包括括药药物物、、蛋蛋白白质质、、脂脂肪肪、、糖糖类类、、橡橡胶胶、、香香精精油油、、色色素素等等这这些些化化合合物物许许多多都都是是高高等等植植物物的的次次生生代代谢谢物物, ,有有些些化化合合物物还还不不能能大大规规模模地地人人工工合合成成, ,而而靠靠植植物物产产生生这这些些化化合合物物产产量量有有限限因因此此, ,利利用用组组织织培培养养方方法法, ,培培养养植植物物的的某某些些器器官官或或愈愈伤伤组组织织, ,并并筛筛选选出出高高产产、、高高合合成成能能力力、、生生长长快快的的细细胞胞株株系系, ,以以进进行行工工业业化生产植物有用化合物化生产植物有用化合物, ,是一条行之有效的途径是一条行之有效的途径n近近年年来来, ,南南京京药药学学院院丁丁家家宜宜利利用用组组织织培培养养生生产产出出人人参参干干粉粉这这是是我我国国第第一一个个用用组组织织培培养养进进行行医医药药的的工工业业化化生产的例子生产的例子 总之，现在的植物组织培养仍然处于发展阶总之，现在的植物组织培养仍然处于发展阶段，很多机理人们还没有搞清楚，它的潜力也远段，很多机理人们还没有搞清楚，它的潜力也远没有发挥出来。

相信在今后的几十年内，组织培没有发挥出来相信在今后的几十年内，组织培养在我国将会有更大的发展，在农业、制药业、养在我国将会有更大的发展，在农业、制药业、加工业等方面将会发挥更大的作用，创造出更大加工业等方面将会发挥更大的作用，创造出更大的经济效益的经济效益思考题思考题n1.1.愈愈伤伤组组织织的的形形态态发发生生有有哪哪两两种种情情况况? ?并并比比较较各自由此形成完整植株的不同各自由此形成完整植株的不同 n2.2.请请以以某某种种植植物物为为例例来来论论述述其其无无菌菌苗苗的的诱诱导导、、继代快繁、生根培养及其驯化移栽过程继代快繁、生根培养及其驯化移栽过程 n3.3.植植物物组组织织培培养养的的主主要要意意义义有有哪哪些些？？最最新新进进展展如何？如何？3.3.7 3.3.7 人工种子人工种子1.1.定义定义n人工种子（人工种子（artificial seed)artificial seed)是指通过植物组织培养是指通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外面还被有的方法获得的具有正常发育能力的材料，外面还被有特定物质，在适宜条件下可以发芽成苗的植物幼体特定物质，在适宜条件下可以发芽成苗的植物幼体。

n19781978年年，由著名的植物学家，由著名的植物学家MurashigeMurashige最早提出人工最早提出人工种子概念种子概念人人工工种种子子2. 人工种子的优点人工种子的优点（（1 1）可根据不同植物的要求配制，如可加入植）可根据不同植物的要求配制，如可加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分等，这物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分等，这样获得的人工种子就优越于天然种子，生产效样获得的人工种子就优越于天然种子，生产效率高；率高；（（2 2）可以固定杂交优势，加速良种繁育；）可以固定杂交优势，加速良种繁育；（（3 3）可作为植物基因工程和遗传工程的桥梁；）可作为植物基因工程和遗传工程的桥梁；（（4 4）可保存珍贵品种可保存珍贵品种选取目标植物选取目标植物从适合的外植体诱导愈伤组织从适合的外植体诱导愈伤组织把愈伤组织转移到液体培养基把愈伤组织转移到液体培养基愈伤组织在液体培养基中增生扩大愈伤组织在液体培养基中增生扩大愈伤组织转移至无激素培养愈伤组织转移至无激素培养体细胞胚体细胞胚包裹人工种皮包裹人工种皮温室（大棚）播种温室（大棚）播种获取目标植物获取目标植物3. 3. 人工种子制作及培养流程图示人工种子制作及培养流程图示4. 4. 人工种子制作的关键环节人工种子制作的关键环节 n（（1 1）制备大量的高质量体细胞胚是人工种子）制备大量的高质量体细胞胚是人工种子制作的前提。

制作的前提n（（2 2）体细胞胚胎发生的同步化控制体细胞胚胎发生的同步化控制n（（3 3）选择合理的包埋技术选择合理的包埋技术 所谓高质量的体细胞胚，所谓高质量的体细胞胚，指的是体细胞胚指的是体细胞胚具有发育成完整小植株的能力，这就要求体细具有发育成完整小植株的能力，这就要求体细胞胚在解剖构造上具有明显的胚根、胚芽的双胞胚在解剖构造上具有明显的胚根、胚芽的双极性结构，极性结构，这是人工种子制作能否成功的关键这是人工种子制作能否成功的关键所在 人工种子的制作要求胚状体的人工种子的制作要求胚状体的形态上大小一致，形态上大小一致，发育进程上相似发育进程上相似，这样制成的人工种子其，这样制成的人工种子其活力强，活力强，萌发率高萌发率高 如何对体细胞胚胎发生进行同步化控制和纯化如何对体细胞胚胎发生进行同步化控制和纯化筛选呢？筛选呢？（（1 1））化学抑制法化学抑制法（（2 2））低温抑制法低温抑制法（（3 3）渗透压选择法）渗透压选择法（（4 4）机械过筛选择法）机械过筛选择法（（5 5）应用植物胚性细胞分级仪）应用植物胚性细胞分级仪化学抑制法：化学抑制法：在细胞培养初期加入抑制在细胞培养初期加入抑制DNADNA合成的合成的药物，使细胞药物，使细胞DNADNA合成暂时停止，当除去合成暂时停止，当除去DNADNA抑制抑制剂时，细胞开始进入同步分裂。

剂时，细胞开始进入同步分裂低温抑制法：低温抑制法：采用低温处理导致发育停滞，形成采用低温处理导致发育停滞，形成所谓的温度冲击，处理时间过后，恢复正常温度，所谓的温度冲击，处理时间过后，恢复正常温度，可以使胚性细胞达到同步分裂的目的可以使胚性细胞达到同步分裂的目的I. I. 人造种皮人造种皮 要求：要求：能保持胚状体的活力，利于萌发或贮藏如海藻能保持胚状体的活力，利于萌发或贮藏如海藻酸钠、明胶、树胶、琼脂糖、淀粉及动物胶等酸钠、明胶、树胶、琼脂糖、淀粉及动物胶等II.II. 人造胚乳人造胚乳 人工胚乳的主要成分为人工胚乳的主要成分为无机盐、碳水化合物及蛋白质无机盐、碳水化合物及蛋白质等等营养物质营养物质III.III.包埋技术包埋技术v滴注法滴注法v装模法装模法滴注法滴注法5. 人工种子的研究现状及应用前景人工种子的研究现状及应用前景n美国加州的植物遗传公司率先申请了胡萝卜等多种植物的人工种美国加州的植物遗传公司率先申请了胡萝卜等多种植物的人工种子的研究专利子的研究专利n瑞士、法国的一些大公司集中研究开发蔬菜芽人工种子和胚芽生瑞士、法国的一些大公司集中研究开发蔬菜芽人工种子和胚芽生产。

产n欧洲多个国家联合攻关的尤利卡计划中，把人工种子的研制作为欧洲多个国家联合攻关的尤利卡计划中，把人工种子的研制作为生物技术研究的重点项目生物技术研究的重点项目n我国在胡萝卜、芹菜、黄连、苜蓿等植物的人工种子的开发应用我国在胡萝卜、芹菜、黄连、苜蓿等植物的人工种子的开发应用上也获得了阶段性成果上也获得了阶段性成果 正因为人工种子在生产和科学研究中具有重要意正因为人工种子在生产和科学研究中具有重要意义，所以国内外都非常重视该领域的研究义，所以国内外都非常重视该领域的研究人工种子的产生是对植物传统繁殖方式的革命人工种子的产生是对植物传统繁殖方式的革命3.3.8 3.3.8 植物组织与器官的生物反应器培养植物组织与器官的生物反应器培养 生物反应器技术生物反应器技术是植物组织或器官培养生产次生代是植物组织或器官培养生产次生代谢产物走向工业化和产业化的关键技术与适用于微生谢产物走向工业化和产业化的关键技术与适用于微生物、植物细胞培养的生物反应器不同，物、植物细胞培养的生物反应器不同，适合植物组织或适合植物组织或器官培养的生物反应器系统具有其特殊性，如需考虑植器官培养的生物反应器系统具有其特殊性，如需考虑植物组织或器官的附着，以及有固定块状培养物带来的营物组织或器官的附着，以及有固定块状培养物带来的营养吸收、气体传递等问题。

养吸收、气体传递等问题利用高度分化的植物器官、利用高度分化的植物器官、组织培养以提高目的产物含量的研究也日益引起人们的组织培养以提高目的产物含量的研究也日益引起人们的重视根、芽、体细胞胚以及冠瘿组织等的培养研究都重视根、芽、体细胞胚以及冠瘿组织等的培养研究都有一定发展有一定发展以以刘春朝刘春朝等人采用生物反应器培养青篙毛状根生产青篙等人采用生物反应器培养青篙毛状根生产青篙素为例来介绍生物反应器的植物组织与器官培养技术及素为例来介绍生物反应器的植物组织与器官培养技术及其应用 青篙素青篙素为世界卫生组织为世界卫生组织( (WHO)WHO)推荐的治疗恶性疟疾推荐的治疗恶性疟疾( (如脑型疟疾和抗氯喹性疟疾如脑型疟疾和抗氯喹性疟疾) )的特效药，具有速效，低的特效药，具有速效，低毒等特点另外，毒等特点另外，青篙素青篙素还有免疫促进作用和抗病毒作还有免疫促进作用和抗病毒作用，可开发抗病毒和抗艾滋病药物世界上青篙素原料用，可开发抗病毒和抗艾滋病药物世界上青篙素原料主要来源我国和越南，由于天然青篙素受气候，季节，主要来源我国和越南，由于天然青篙素受气候，季节，虫害等限制每年青蒿素的产量远远不能满足市场需求，虫害等限制。

每年青蒿素的产量远远不能满足市场需求，因此供不应求因此供不应求121151091414135231647一体化设计的一体化设计的雾化生物反应器雾化生物反应器（（培养青篙毛状根生产青篙素培养青篙毛状根生产青篙素））1 生物反应器生物反应器2 中心筒中心筒3 不锈钢筛网不锈钢筛网4 空气出口空气出口5 时间继电器时间继电器6 雾化头雾化头7 培养液培养液8 空气入口空气入口9 空气过滤器空气过滤器10 流量计流量计11 电磁阀电磁阀12 空气储罐空气储罐13 雾化装置雾化装置14 40w日光灯日光灯8雾化反应器雾化反应器3.3.10 3.3.10 植物组织与器官培养存在的问题植物组织与器官培养存在的问题1.1. 研究中的问题研究中的问题 对于植物全能性表达和激素作用机制等尚未开展深入研究，而对于植物全能性表达和激素作用机制等尚未开展深入研究，而且对于培养比较困难的植物缺乏研究且对于培养比较困难的植物缺乏研究2.2. 技术上的问题技术上的问题 效率偏低、操作比较繁琐、培养结果比较难以确定等技术问题效率偏低、操作比较繁琐、培养结果比较难以确定等技术问题还需解决。

还需解决3.3. 可应用性范围可应用性范围 目前有许多植物还未培养成功，许多有意义的杂交亲本或组合目前有许多植物还未培养成功，许多有意义的杂交亲本或组合还不能培养成功，或不能有效培养成功还不能培养成功，或不能有效培养成功4.4. 生物反应器技术生物反应器技术 （（1 1）适用于不同培养对象的新型生物反应器的研制适用于不同培养对象的新型生物反应器的研制 （（2 2）提高生物反应器技术内部培养物生长的均匀性和空间利用率提高生物反应器技术内部培养物生长的均匀性和空间利用率 （（3 3）培养物接种、取样、无菌化等操作技术的优化培养物接种、取样、无菌化等操作技术的优化 （（4 4）不同培养体系生物反应器培养的动力学研究与工艺优化控制不同培养体系生物反应器培养的动力学研究与工艺优化控制 （（5 5）生物反应器培养的放大技术生物反应器培养的放大技术3.4 3.4 植物细胞培养植物细胞培养3.4.1 3.4.1 定义定义3.4.2 3.4.2 植物细胞培养的方法植物细胞培养的方法3.4.3 3.4.3 植物细胞培养的培养基植物细胞培养的培养基3.4.4 3.4.4 植物单细胞培养植物单细胞培养3.4.5 3.4.5 植物细胞培养的意义植物细胞培养的意义3.4.6 3.4.6 植物细胞的生物反应器大规模培养植物细胞的生物反应器大规模培养（自学）（自学）3.4.7 3.4.7 植物细胞两相培养技术植物细胞两相培养技术（自学）（自学）3.4.8 3.4.8 植物细胞的生物反应器固定化培养植物细胞的生物反应器固定化培养（自学）（自学）3.4.9 3.4.9 植物细胞培养存在的问题与发展趋势植物细胞培养存在的问题与发展趋势3.4.1 3.4.1 定义定义 植物细胞培养植物细胞培养（（plant cell culture)plant cell culture)是指在离体条是指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养集件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养集中，进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过中，进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。

术 植物细胞培养的理论基础植物细胞培养的理论基础是植物细胞的单个细胞内是植物细胞的单个细胞内存在生命体的全部能力（全能性）存在生命体的全部能力（全能性）3.4.2 3.4.2 植物细胞培养的方法植物细胞培养的方法• 根据根据培养对象培养对象，植物细胞培养主要有，植物细胞培养主要有单细胞培单细胞培养、单倍体培养、原生质体培养等养、单倍体培养、原生质体培养等• 根据根据培养系统培养系统分为分为悬浮培养、液体培养、固体悬浮培养、液体培养、固体培养、固定化培养等培养、固定化培养等• 植物细胞培养系统分类植物细胞培养系统分类（（图示图示）细胞培养细胞培养固体培养固体培养液体培养液体培养琼脂培养琼脂培养固定化培养固定化培养摇瓶悬浮培养摇瓶悬浮培养反应器大规反应器大规模培养模培养分批培养分批培养半连续培养半连续培养连续培养连续培养恒化培养恒化培养恒浊培养恒浊培养植物细胞培养系统分类植物细胞培养系统分类3.4.3 3.4.3 植物细胞培养的培养基植物细胞培养的培养基 培养基（培养基（culture mediumculture medium））是植物细胞培养是植物细胞培养中最主要的部分，除了培养材料本身的因素外，中最主要的部分，除了培养材料本身的因素外，培养基的种类成分等直接影响培养材料的生长发培养基的种类成分等直接影响培养材料的生长发育，应根据育，应根据培养材料的种类和培养部位培养材料的种类和培养部位选取适宜选取适宜的培养基。

的培养基培培养养基基的的主主要要成成分分水水无机成分无机成分有机成分有机成分无机大量元素：无机大量元素：在培养基中含量超在培养基中含量超过过100100mg/Lmg/L的无机元素，包括的无机元素，包括N,P,K,Ca,Mg,SN,P,K,Ca,Mg,S等无机微量元素：无机微量元素：在培养基中含量低在培养基中含量低于于100100mg/Lmg/L的无机元素，包括的无机元素，包括Fe,Fe,MnMn,B,Zn,Cu,Mo,Co,,B,Zn,Cu,Mo,Co,ClCl糖糖维生素维生素肌醇肌醇氨基酸及有机添加物氨基酸及有机添加物植物生长调节物质植物生长调节物质琼脂琼脂3.4.4 3.4.4 植物单细胞培养植物单细胞培养 单细胞培养单细胞培养（（single cell culturesingle cell culture））是从不同是从不同植物中获得单细胞无性系进行细胞杂交及研究细胞的植物中获得单细胞无性系进行细胞杂交及研究细胞的分裂、分化、生长及发育的重要方法，并为大规模培分裂、分化、生长及发育的重要方法，并为大规模培养奠定基础养奠定基础分离的单细胞分离的单细胞看护培养看护培养微室培养微室培养平板培养平板培养悬浮培养悬浮培养单细胞无性系单细胞无性系1. 1. 单细胞制备方法：单细胞制备方法：l愈伤组织或悬浮培养物愈伤组织或悬浮培养物( (常常) ); ;l用用纤维素酶和果胶酸酶纤维素酶和果胶酸酶从组织分离从组织分离 （（1）机械法）机械法 （（2）酶解法）酶解法 （（3）愈伤组织诱导法）愈伤组织诱导法由组织器官经愈伤组织分离单细胞由组织器官经愈伤组织分离单细胞步骤：步骤：1）） 诱导产生愈伤组织；诱导产生愈伤组织；2）） 愈伤组织反复继代，使组愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织松织不断增殖，提高愈伤组织松散性；散性；茎段茎段悬浮悬浮振荡培养振荡培养3）将愈伤组织在液体培养基中）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物培养，建立悬浮培养物优点：优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。

中均匀分布；有空气交流2. 单细胞培养方法单细胞培养方法 （（Single cell culture）） 单细胞培养常用的方法：单细胞培养常用的方法：（（1）看护培养法（）看护培养法（Nurse culture））用途用途：：诱导形成单细胞系诱导形成单细胞系含义含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法护单个细胞，并使其生长和增殖的方法用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖这个愈伤组织块称为其生长和增殖这个愈伤组织块称为看护愈伤组织看护愈伤组织a.a.看护培养的含义及用途看护培养的含义及用途（（1））在在一一个个培培养养瓶瓶中中加加入入一一定定量量厚厚的的固固体体培培养养基基，，灭灭菌菌后后备用2））在在无无菌菌条条件件下下，，将将一一小小块块（（1cm3））活活跃跃生生长长的的愈愈伤伤组组织织接接种种到到培培养养基基上上，，再再在在愈愈伤伤组组织织块块上上放放一一片片（（1cm²））已灭菌的滤纸，放置一晚上已灭菌的滤纸，放置一晚上3））将将分分离离的的单单细细胞胞接接种种到到培培养基的滤纸上。

养基的滤纸上4）恒温培养恒温培养b.b.看护培养基本技术看护培养基本技术优点：优点：（（1）简便易行简便易行2）效果好，易于成功效果好，易于成功缺点：缺点：（（1）不能在显微镜下直接观察细胞）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程的生长过程c. 看护培养特点：看护培养特点：a. 微室培养的含义及用途微室培养的含义及用途用途用途:主要用来观察细胞生长、分裂、主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程形成细胞团的过程2）微室培养法）微室培养法（（Microculture））第一节第一节 单细胞培养单细胞培养含义含义:将单细胞培养在少量的培养基中将单细胞培养在少量的培养基中微室培养图示：微室培养图示：1滴含单细胞培养液滴含单细胞培养液周围加石蜡油周围加石蜡油凹穴载凹穴载玻片玻片旁边加石蜡油旁边加石蜡油盖盖玻片盖盖玻片盖盖玻片盖盖玻片平视图平视图置培养皿中置培养皿中26~28 ℃℃恒恒温培养温培养 b. 微室培养特点：微室培养特点：优点：优点： （（1 1）在培养过程中，可以连续进）在培养过程中，可以连续进行显微观察一个细胞的生长、分裂和行显微观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程形成细胞团的全部过程缺点：缺点： （（1））培养时间较短培养时间较短（（3）平板培养法（）平板培养法（Plante Culture））a. 含义及用途：含义及用途：v含义含义: 将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。

后平铺一薄层在培养皿底上的培养法v用途用途: 分离单细胞无性系，研究其生理、生化、分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养培养基培养基植物叶片植物叶片单细胞单细胞平板平板可采用哪些可采用哪些方法？方法？固体平板培养图示：固体平板培养图示：b. 特点特点优点：优点：（（1 1）可以定点观察；）可以定点观察；（（2 2）分离单细胞系容易；）分离单细胞系容易；缺点：缺点：（（1 1）培养细胞气体交换不畅培养细胞气体交换不畅 (1)(1)、悬浮细胞密度的调制、悬浮细胞密度的调制 平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为度）为1×10 1×10 ³ -100×10 -100×10 ³ 个个/ml/ml c. 平板培养的基本技术平板培养的基本技术l初始植板密度：初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度1.4%1.4%琼脂基本培养基琼脂基本培养基+ +等量细胞培养液等量细胞培养液=0.7 % =0.7 % 琼脂条件培养基。

琼脂条件培养基条件培养基：条件培养基：曾悬浮培养过一段时间组织或曾悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基细胞的液体培养基2）培养基配制）培养基配制植板效率（或植板率）：植板效率（或植板率）：已形成细胞团已形成细胞团的百分数（即每的百分数（即每100100个铺在平板上的细胞个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）中有多少个能长出细胞团） (4) 培养：培养： 26℃℃置暗处培养置暗处培养21天低倍显微天低倍显微镜观察，镜观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置板效记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）率（也称植板率）3）制平板）制平板：：细胞悬浮液与融化状态（细胞悬浮液与融化状态（35 ℃℃ ））条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板（（4）双层滤纸植板培养法）双层滤纸植板培养法（（5）） 细胞悬浮培养（细胞悬浮培养（Suspension culture））特点特点 1 1））细细胞胞营营养养吸吸收收、、环环境境条条件件好好，，细细胞胞增增殖殖快快, , 形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；形成高密度的细胞群体，适于大规模培养； 2 2））能能够够提提供供大大量量较较为为均均匀匀的的细细胞胞，，为为研研究究细细胞胞的生长、分化创造方法和条件。

的生长、分化创造方法和条件含义：含义：将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中 进行的无菌培养进行的无菌培养悬浮培养类型和方法悬浮培养类型和方法成批培养成批培养连续培养连续培养a. 成批培养成批培养/分批培养（分批培养（Batch culture）） 含含义义：：将将愈愈伤伤组组织织培培养养在在一一定定容容积积的的密密闭闭容容器器中中进进行行培培养养它它是是进进行行细细胞胞生生 长长和和细细胞胞分分裂裂的的生生理理生生化化研研究究常常用用的的培培养养方方法成批培养特点成批培养特点Ø （（1 1）培养基体积固定；）培养基体积固定；（（2 2）必须适当搅拌；）必须适当搅拌；（（3 3）培养过程中，细胞生长，其数）培养过程中，细胞生长，其数目不目不 断发生变化，呈断发生变化，呈S S增长；增长；（（4 4）但要进行下一批培养，则生长）但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移一定时间后，需要继代转移 培养时间培养时间培培养养细细胞胞数数目目12345延迟期延迟期对数生长期对数生长期直线生长期直线生长期缓慢期缓慢期静止期静止期12345细胞生长曲线细胞生长曲线成批培养的方法成批培养的方法(1)旋转培养旋转培养(2)往返震荡培养往返震荡培养(3)旋转震荡培养旋转震荡培养(4)搅动培养搅动培养b. 连续培养（连续培养（Continuous culture））含义：含义：指在培养过程中，以不断抽取悬指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。

培养连续培养的特点：连续培养的特点：（（1 1））新鲜培养基的不断加入新鲜培养基的不断加入, ,保证了养分保证了养分的充分供应的充分供应；；（（2 2））可使细胞保持在增殖旺盛的对数生可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中长期中；；（（3 3））适于大规模工业化生产适于大规模工业化生产n(1)(1)半连续培养半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液液，同时补充加入等量的新鲜培养液n(2)(2)连续培养连续培养：： 封闭式和开放式封闭式和开放式连续培养的种类：连续培养的种类：Production of anthocyanin加入培养基加入培养基排出培养基及其培养物排出培养基及其培养物连续培养图示：连续培养图示：ü1 1、条件培养基、条件培养基ü2 2、细胞密度、细胞密度(>(>临界密度临界密度) )ü3 3、生长激素、生长激素ü4 4、、pHpHü5 5、、CO2CO23. 影响单细胞培养的因子影响单细胞培养的因子4. 4. 细胞的保存细胞的保存（（1 1）继代培养保存法）继代培养保存法 悬浮培养的细胞每隔悬浮培养的细胞每隔1-21-2周换液进行继代培养。

如周换液进行继代培养如高等植物细胞、海藻等的细胞高等植物细胞、海藻等的细胞2 2）低温保存法）低温保存法 一般选择一般选择5-10℃ 5-10℃ 的温度下培养，每隔的温度下培养，每隔1010天换液3 3）冰冻保存法）冰冻保存法 1 1）低温保存）低温保存 - -20℃ 20℃ 左右保存细胞左右保存细胞 2 2）超低温保存）超低温保存 液氮保存温度达到液氮保存温度达到-196℃ -196℃ 效果最理想效果最理想3.4.5 3.4.5 植物细胞培养的意义植物细胞培养的意义 目前利用植物细胞培养技术生产植物产品目前利用植物细胞培养技术生产植物产品已成为已成为工业化工业化生产植物产品的一条生产植物产品的一条有效途径有效途径 随着植物细胞悬浮培养技术的发展，单细随着植物细胞悬浮培养技术的发展，单细胞培养的成功，加之各种新型生物反应器的问胞培养的成功，加之各种新型生物反应器的问世，使得植物细胞有可能象微生物那样在发酵世，使得植物细胞有可能象微生物那样在发酵罐中大量连续培养。

因此在人为条件下大规模罐中大量连续培养因此在人为条件下大规模培养这些植物细胞具有极大的培养这些植物细胞具有极大的经济吸引力经济吸引力 与整株植物栽培相比，细胞培养技术的优点包括：与整株植物栽培相比，细胞培养技术的优点包括：（（1 1））代谢产物的生产是在控制条件下进行的，代谢产物的生产是在控制条件下进行的，因此可以通因此可以通过选择优良细胞系和优化培养条件等方法得到超越整株植物过选择优良细胞系和优化培养条件等方法得到超越整株植物产量的代谢产物不仅节约能源，减少耕地占用面积，而且产量的代谢产物不仅节约能源，减少耕地占用面积，而且不受季节、地域的限制不受季节、地域的限制2 2））细胞培养是在无菌条件下进行的，细胞培养是在无菌条件下进行的，因此可以排出病菌因此可以排出病菌和害虫的影响和害虫的影响3 3））可以通过特定的生物转化途径获得均一的有效成分可以通过特定的生物转化途径获得均一的有效成分4 4））可以探索新的合成路线，获得新的有用物质可以探索新的合成路线，获得新的有用物质 总之，利用植物细胞培养进行有用物总之，利用植物细胞培养进行有用物质生产质生产不受时间、环境等条件限制不受时间、环境等条件限制，而且，而且快速、高效快速、高效。

植物细胞培养用于具有生理植物细胞培养用于具有生理活性的活性的次生代谢产物次生代谢产物的生产方面现已成为的生产方面现已成为继微生物发酵技术以后当代生物技术的一继微生物发酵技术以后当代生物技术的一个个重要应用技术重要应用技术思考题思考题n1. 1. 如何制作人工种子？制作过程中要注意哪如何制作人工种子？制作过程中要注意哪些关键环节？些关键环节？n2. 2. 与天然种子相比，人工种子有哪些优缺点与天然种子相比，人工种子有哪些优缺点？？n3. 3. 植物细胞培养的营养成分主要包括哪些？植物细胞培养的营养成分主要包括哪些？分别起什么作用？分别起什么作用？n4. 4. 植物单细胞培养有哪些方法？指出每一种植物单细胞培养有哪些方法？指出每一种培养方法的要点培养方法的要点3.5 3.5 植物原生质体培养植物原生质体培养n3.5.1 3.5.1 原生质体原生质体n3.5.2 3.5.2 原生质体的制备原生质体的制备n3.5.3 3.5.3 原生质体培养原生质体培养n3.5.4 3.5.4 原生质体的发育和植株再生原生质体的发育和植株再生n3.5.5 3.5.5 应用举例应用举例3.5.1 3.5.1 原生质体原生质体1. 定义定义 植物原生质体植物原生质体（（protoplast)protoplast)是指将植物细胞壁除去是指将植物细胞壁除去后得到裸露的球形细胞。

后得到裸露的球形细胞通常通过混合酶液的消化细胞壁而获通常通过混合酶液的消化细胞壁而获得，原生质体经适宜的培养能合成新壁，并进行细胞分裂，从得，原生质体经适宜的培养能合成新壁，并进行细胞分裂，从而生成完整植株而生成完整植株植物细胞形态植物细胞形态植物细胞质壁分离植物细胞质壁分离 2. 2. 原生质体的特点原生质体的特点（（1 1）无细胞壁障碍，可方便地进行有关遗传操）无细胞壁障碍，可方便地进行有关遗传操作，并可以对膜、细胞器等进行基础研究作，并可以对膜、细胞器等进行基础研究2 2）具有全能性，并能进行人工培养发育成完）具有全能性，并能进行人工培养发育成完整植株3 3）原生质体适合进行诱导融合形成杂种细胞原生质体适合进行诱导融合形成杂种细胞 3. 3. 原生质体的用途原生质体的用途（（1 1）提供相关生理生化研究（）提供相关生理生化研究（如细胞壁的生物合成、质如细胞壁的生物合成、质膜的结构与功能、物质运输、能量转换、信息传递、膜的结构与功能、物质运输、能量转换、信息传递、细胞识别、细胞间相互关系与激素作用等细胞识别、细胞间相互关系与激素作用等）的材料2 2）利用原生质体可摄取）利用原生质体可摄取如病毒、细菌、细胞器、蛋白如病毒、细菌、细胞器、蛋白质、核酸等外源物质质、核酸等外源物质的特点而被用作研究的特点而被用作研究基因调控和基因调控和表达、遗传工程表达、遗传工程研究研究的材料。

的材料3 3）进行原生质体融合，改变遗传物质，建立杂交品种；）进行原生质体融合，改变遗传物质，建立杂交品种；同时用于同时用于研究染色体行为、基因定位等研究染色体行为、基因定位等4 4）用于细胞器的分离，或进行相关细胞器的遗传实验用于细胞器的分离，或进行相关细胞器的遗传实验3.5.2 3.5.2 原生质体的制备原生质体的制备n原生质体的来源原生质体的来源n原生质体的分离原生质体的分离n原生质体纯化原生质体纯化n原生质体鉴定与活力测定原生质体鉴定与活力测定原生质体的来源：原生质体的来源： 从从理理论论上上讲讲，，植植物物体体的的任任何何一一部部分分都都可可以以通通过过酶酶解解作作用用去去除除细细胞胞壁壁而而得得到到原原生生质质体体但但在在实实际际操操作作中中，，只只有有幼幼嫩嫩的的组组织织才才能能完完成成去去壁壁的的过过程程所所以以，，为为了了制制备备健健康康的的原原生生质质体体，，一一般般选选用用根根尖尖、、茎茎尖尖、、嫩嫩叶叶及及对对数数生生长长期期的的愈愈伤伤组组织织为为材材料料，，还还有有植植物物花花粉粉，，用用于于制制备备单单倍倍体体的的原原生生质质体体以以及及体体细细胞胞胚胚及及悬悬浮浮培培养养细细胞胞中中获获得得，，一一旦旦细细胞胞具具有有木木质质化化或或次次生生加加厚厚的的外外壁壁，，则则不不能能被被酶酶降降解解。

因因此此，，取取材材成成为为实实验验成成功功与与否否的的首首要要问问题 原生质体的分离：原生质体的分离：（（1）机械法）机械法18921892年，年，KlerckerKlercker采用机械法剥离原生质体，但该法采用机械法剥离原生质体，但该法手工操作难度大，费时费力，得率很低手工操作难度大，费时费力，得率很低2）酶解法）酶解法该法具有条件温和，原生质体完整性好，活力高、得该法具有条件温和，原生质体完整性好，活力高、得率高等优点率高等优点常有的酶有：琼脂酶、果胶酶、蜗牛酶、纤维素酶等常有的酶有：琼脂酶、果胶酶、蜗牛酶、纤维素酶等原生质体纯化：原生质体纯化：1.1.过滤过滤- -离心法离心法2.2.漂浮法漂浮法3.3.沉降法和漂浮法结合沉降法和漂浮法结合原生质体鉴定与活力测定原生质体鉴定与活力测定1.1.原生质体鉴定原生质体鉴定2.2. 经分离、纯化后的原生质体需要进行鉴定，以检验所经分离、纯化后的原生质体需要进行鉴定，以检验所获得的原生质体是否是真正的原生质体其方法有：获得的原生质体是否是真正的原生质体其方法有：3.3.（（1 1）低渗爆破法）低渗爆破法4.4.（（2 2）荧光染色法）荧光染色法5.5.2. 2. 原生质体活力测定原生质体活力测定6.6.（（1 1）染色法）染色法7.7.（（2 2）胞质环流法）胞质环流法8.8.（（3 3）渗透压变化）渗透压变化9.9.（（4 4）氧电极法）氧电极法3.5.3 3.5.3 原生质体培养原生质体培养用于原生质体培养的方法有：用于原生质体培养的方法有：1.液体培养法液体培养法2.固体平板法固体平板法3.双层培养法双层培养法3.5.4 3.5.4 原生质体的发育和植株再生原生质体的发育和植株再生1.细胞壁再生细胞壁再生2.分裂分裂3.愈伤组织或胚状体的形成愈伤组织或胚状体的形成4.植株再生植株再生3.5.5 3.5.5 原生质体培养再生植株的应用举例原生质体培养再生植株的应用举例 以以多多年年生生大大花花萱萱草草为为例例，，学学习习植植物物原原生生质质体体的培养技术。

的培养技术1.1.取取盛盛开开的的大大花花萱萱草草作作为为实实验验材材料料，，我我们们可可以以看看到到在在每每一一个花瓣上都具有红、黄、白三种颜色个花瓣上都具有红、黄、白三种颜色盛开的大花萱草盛开的大花萱草2.2.花瓣表皮为排列紧密的表皮组织，不易酶解，用花瓣表皮为排列紧密的表皮组织，不易酶解，用尖头镊子撕去表皮尖头镊子撕去表皮将暴露的花肉组织浸泡在酶液将暴露的花肉组织浸泡在酶液里排列相对疏松的花肉细胞很容易被酶液消化排列相对疏松的花肉细胞很容易被酶液消化 3.3.将将暴暴露露的的花花肉肉组组织织浸浸泡泡在在酶酶液液里里在在酶酶液液消消化化过过程程中中，，由由于于实实验验材材料料的的个个体体差差异异，，酶酶解解时时间间不不固固定定因因此此要要用用显微镜随时检查酶解情况显微镜随时检查酶解情况 4.4.酶酶解解好好的的原原生生质质体体经经300300目目尼尼龙龙网网过过滤滤到到离离心心管管中中，，除除去去未未消消化化的的大大块块组组织织离离心心5 5分分钟钟（（500-1000500-1000转转/ /分分））使使悬悬浮浮的的原原生生质质体体下下降降至至离离心心管管底底部部，，缓缓缓缓倾倾倒倒出出上上清清液液，，加加入入培培养养液液，，吹吹打打使使其其悬悬浮浮，，再再离离心心，，重重复复2 2次次，，目目的的是是洗洗去去酶酶液，使原生质体悬浮在等渗培养基中。

液，使原生质体悬浮在等渗培养基中 5.5.显显微微镜镜检检查查清清洗洗后后的的原原生生质质体体，，如如碎碎片片过过多多，，则则用用蔗蔗糖糖漂漂浮浮法法去去除除碎碎片片蔗蔗糖糖漂漂浮浮法法：：细细口口吸吸管管吸吸20%20%蔗蔗糖糖溶溶液液，，小小心心插插入入盛盛有有原原生生质质体体悬悬液液的的离离心心管管底底部部，，缓缓缓缓将将蔗蔗糖糖溶溶液液挤挤出出，，由由于于比比重重不不同同，，蔗蔗糖糖溶溶液液与与原原生生质质体体悬悬液液中中间间有有一一明明显显界界面面. . 离离心心5 5分分钟钟（（500500转转/ /分分）），，此此时时死死细细胞胞及及碎碎片片降降至至蔗蔗糖糖溶溶液液内内，，聚聚集集在在离离心心管管底底部部，，而而活活细细胞胞由由于于有有大大量量泡泡沫沫，，故故漂漂浮浮在在上上下下界界面面处处，，用用细细管管轻轻轻轻插插入入底底部部将将沉沉降降在在离离心心管管底底部部的的碎碎片片小小心心吹吹打打，，混混匀匀在在蔗蔗糖糖溶溶液液中中，，连连同同蔗蔗糖糖溶溶液液一一起起小小心心吸吸出出，， 再再吸吸去去上上清清液液即即得得到到健健康康的的原原生生质体 6. 6. 接接种种原原生生质质体体于于合合适适的的培培养养基基上上进进行行培培养养。

当当原原生生质质体体发发育育成成的的愈愈伤伤组组织织分分化化出出球球芽芽后后，，将将其其移移植植进进培培养养瓶中继续培养，诱导分化出苗，继而发育成完整植株瓶中继续培养，诱导分化出苗，继而发育成完整植株思考题思考题重点将教材第3章后的课后题进行思考练习。