脱盐柱装柱注意事项.docx

介绍几点 Sephadex 的粗浅经验吧： 1、选柱原则：交联葡聚糖凝胶在大 G 值时，柱过长就会影响流速，此时选用柱一般都较短而稍粗反之 ，G 值小时用柱不妨长些待分离物质的分子量与 G 值有一定的关系，可以参阅一些书本 2、装柱前要仔细把柱底和管子内的气体排出，当然这要有些技巧的 3、装柱时速度要慢些，放的速度与装凝胶的速度要保持一致这样才能避免产生气泡和分层 4、液位差不能超出正常范围，否则凝胶会变形，至少会影响流速常用正常值如下： G-25：40-160cm G-100：24-96cm G-150：9-36cm G-200：4-16cm 5、样品上柱量 ：SephadexG-200 的凝胶上柱体积，大约是床体积的 1/50 左右，小 G值的凝胶上柱体积则大约是床体积的 1/100 左右如果待分离两物质的分子量靠得很近，上述体积比还可以小些如果上柱样品的比重大一点，上样的样品能形成很好的界面 6、上样时切勿冲动床面，也不能使凝胶干涸 7、样品洗脱峰的检测：蛋白质测定常用波长 280nm，但如蛋白质样品很稀，则可在230-235nm 波长处检测謻肽不含酷氨酸和色氨酸，极个别蛋白质也不含两种氨基酸，则必须用 225nm 波长。

首先肯定是用下层的，你可以看下下层体积够不，G-25 溶胀体积 2.5ml/g，再一个取下层微球在显微镜下看球的粒径情况，球是否充分溶胀，有溶胀后的粒径大小，一般湿胶是 38um~235um再一个看看上层絮状物在显微镜下的情况，这种情况都会遇到的，直接把上层倒掉，用下层胶装柱3 使用方法3.1 乙醇浸泡 在室温下，将干粉浸泡于 50-60%乙醇中至少 24 小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用去离子水洗去残存的乙醇滤干3.2 去离子水浸泡室温下，在去离子水中充分溶胀 24 小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀3.3 盐酸浸泡在常温下再用 0.2N HCl 浸泡 12 小时，间隙搅拌，滤干，水洗至中性3.4 装柱将溶胀好的凝胶根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层3.5 平衡上样前平衡层析柱至少 3-5 个柱体积直到基线变得平稳为止（流出液的 PH 值等于上柱的 Buffer 的 PH值）3.6 上样凝胶过滤的上样量一般为 5%的柱床体积，我们建议初次上样控制在 1-2%的床体积，视分离情况可以调整；脱盐时上样量可以达到 20%的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱高控制在 40-50 cm 以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免。

难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为 5：1 即可3.7 洗脱方法可以用去离子水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱 Buffer 中加入 NaCl 等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化3.8 在位清洗（CIP）凝胶使用十次后作一次 CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白方法是以 40cm/h 用 1M 氢氧化钠反向洗四个柱体积，再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。