青枯雷尔氏菌菌株的DNA多态性分析.docx

青枯雷尔氏菌菌株的DNA多态性分析郑雪芳，刘波・，林营志，曹宜，车建美（福建省农科院生物技术研究所生物农药研究室 福建 福州 350003）摘 要：应用ITS1区序列分析和RAPD技术对17个采自不同地区，不同寄主作物的青枯雷尔氏 菌株进行DNA多态性分析结果表明，青枯雷尔氏菌株的ITS1IX序列斧异不大只有一、两个碱 基的差异在此基础上，利用RAPD技术进一步分析表明，17个供试的青枯雷尔氏菌基因组DNA 间存在丰富的多态性聚类分析这17个菌株，可聚为4个簇群从聚类结果显示，青枯菌的遗 传差异性主要来自寄主作物的不同，而与地域差异性关系不大关键词：青枯菌;DNA多态性;ITS； RAPDDNA Polymorphism Analysis of Raistonia SolanacearumZHEN Xue-fang, LIU Bo, LIN Ying-zhi, CAO Yi, CHE Jian-meiAbstract:DNA polymorphism among 17 strains of R-solanacearum from different climate 刁ones and different host crop was anal ysed by TTS1 sequenee and RAPD methods respecti vely. The results showed that there was one or two base diversity among ITS1 sequence of R-solanacearum. The total genomic DNA was then examined by sensitive RAPD technique. The results revealed tin obvious diversity of their genomic DNA・ Cluster analysis based on the RAPD bands showed that 17 isolates could be separated into 4 clusters. It is concluded that genetic cliversity of R-solanacearummost 1 y comes from different host crop but not comes from different climate zones.Key words： Ralstonia solanacearum； DNA polymorphism； ITS； RAPD青枯病是由青枯假单泡杆菌引起的毁灭性细菌病害，广泛分布于热带、亚热带及温带地区， 在我国南方各省市均有严重发生。

己报道的发生青枯病的植物超过40多个科，有200百多个种 丁，包括茄科植物、木麻黄属、鹤望兰属、姜属、芭蕉属、花生等许多经济地位很重要的作物 如马铃属、番茄、烟草、香蕉等都被侵染,还有一些贵重药材和花卉也被侵染,是生产上主要 的限制因子根据对不同植物种类的致病性差异，R'solanacearum被划分为5个小种；根据不同菌株对3 种双糖和3种已醉的氧化产酸能力，R-solanacearum被划分为5个生化变种，只有3号小种和 生化变种2、5号小种和生化变种5是相互等同的3近年来，有许多研究人员开始应用分子生基金项目:国家863计划项目（2002AA244031-2）；福建省计委项目（闽计农经[2002]48号） 水通迅作者：Te 1:13905917339; Fax:0591-87303160; E-mMl:fzliubo@163. com作者简介：郑雪芳（1977-）,女（汉族），福建莆田人，硕士,主要从事生物技术研究E-mai1: zhengxuefang@eyou. com物技术来划分青枯菌例如，seal等⑶,用RNA保守物PCR技术将来源不同的112个青枯菌划 分为3个“指纹”组，结果与COOK等"报道的利用RFLP技术获得的青枯菌“区纟相吻合。

G订ling 等s通过对扩增的多聚半乳糖醛酸酶基因片段RFLP分析，将来源不同的48个青枯菌分离的分为 6个RFLP型；Jul in等一「应用RC-PFGE和REP-PCR技术研究了 46个肯尼亚青枯菌分离物及39个 来白不同国家菌株的遗传多样性，并进行了 “分型”，这些研究都说明了青枯菌DNA存在丰富的 遗传多样性木研究拟通过对青枯菌ITS序列的分析比较及RAPD技术来研究不同地区、不同寄 主作物青枯雷尔氏菌菌株的遗传差异1材料与方法1.1菌株及培养基供试菌株及来源详见表1,菌株采用TTC培养基：匍萄糖0.5%、蛋白豚1.0%、水解酪蛋白 0.1%、琼脂1.7%；另配制1. 0%TTC (2, 3, 5--氯化三苯基四氮卩坐)溶液,12VC灭菌2-8分钟; 然后每100ml培养基加入1. 0%TTC溶液0. 5ml,即配制成TTC培养基,冷却至60C后制平板备 用，TTC液体培养基与固体基本相同，只是不加琼脂表1供试菌株Tab・ 1 Strains used in this studv菌种序号菌种编号來源采集地点1Rs-F. 1.1-010615-04V番茄植株福州建新2Rs-F. 1.2-010618-07V番茄植株福州农大3Rs-F. 1.3-010702-I2A番茄植株福州北峰4Rs-F. 1.2-010618-13A祈茄植株福州农大5Rs-E9.1-010620-I4A番茄植株福建南平6Rs-F. 1.3-020626-3A番茄植株福州北峰7Rs-F. 1.3-020626-2A番茄植株福州北峰8Rs-L. 1.3-010719-3 V茄子植株福州北峰9Rs-L. 1.3-020626- IA茄了植株福州北峰10Rs・L」.3-020626-3V茄子植株福州北峰11Rs-L. 1.2-010809-A茄子植株福州农大12Rs-L.9.2-010620-V茄子植株福建南平13Rs-J. 1.4-010704-0IV生姜植株福州永泰14Rs-J. 1.4-010704-02A生姜植株福州永泰15Rs-P. 1.4-010704-0IV辣椒植株福州永泰16Rs-F. 1.3-010702-0 IV-fl番茄植株福州北峰17Rs-F. 1.3-010702-0 IV-f 10番茄植株福州北峰1.2菌株基因纟RDNA制备采用 CTAB ' Ji (Hexadecyl trimethyl ammonium—bromide)。

1.3 1TS-PCR扩增的引物设计青枯菌有4个rm,其中一个位于大质粒，4个rrn的序列基本一致，其中1TS1和1TS2区 完全相同，大质粒上 心 的23S部位有4个位点与位于染色体上的不同设计引物扩增16S和23S 之间的 ITS1 区引物序列：Pf： GCCAAGGCATCCACCACA, Pr： AGGAGGGCGATTACCACG016SrRNA ITS 23S rRNA ITS 5S rRNAtRNA-lle tRNA・Ala1.4青枯菌ITS-PCR特异扩增青枯雷尔氏菌ITS-PCR扩增体系体系为:扩增总体积为25 U L,包括1个单位的Taq酶,2. 5 u L 的 10X PCR Buffer, 3M MgCb, 0. 15 mM 的 4 种 dNTP, 15 pM 的 ITS 引物，DNA 模板 25 ng PCR 仪为 MJ Reseach, Inc 生产的 PTC-100TM Programmable Thermal Control 1 er« PCR 反应程 序：94°C 30 sec, 58°C 30 sec, 72°C 30 sec,进行 28 个循环，最后 72°C延伸 7 min0 扩增 结束后，取6 u L PCR产物在含有1.5%的琼脂糖凝胶中电泳以检查扩增结果，电压120伏。

电 泳结束示在Gel Doc 2000紫外凝胶成像系统(Bio-Red)上观察并贮存图像1.5产物纯化及测序将ITS-PCR扩增产物电泳后切胶冋收，利用Takara公司的PCR Fragment Recovery Kit纯化, 将纯化产物送至大连宝生物工程有限公司进行直接测序1.6序列分析用DNAStar软件将供试菌株序列与参比菌株GMI1000 ITS1区序列(由Genbank ±获取)进 行比对1.7 RAPD分析的随机扩增步骤与方法和特异性扩增基木相同从30个RAPD随机引物中(上海生工生物工程技术服 务有限公司)筛选出7个能获得清晰多态性条带的反应稳定的引物PCR扩增反应在25 n L反应 体系中进行,体系中包括2.5uL的10X PCR Buffer, 200u M的4种dNTP, 10pM的RAPD引物， 1个单位Taq DNA聚合酶,并加入约25ng的模板DNAPCR反应程序为35个循环,每1循环的 程序为94°C变性lmin, 51C复性lmin, 72°C延伸2min,最后1个循环72°C延伸3min,扩增结 束后，取6uL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳以检查扩增结果，在Gel Doc 2000凝胶成像 系统(Bio-Rad)上观察并贮存图像。

1.8数据分析参照RAPD扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱，每一条DNA带均为一个分了标记，并代表一个引 物结合位点根据各分了标记的迁移率及其有无统计所得位点的二源数据：有带计为“1”，无 带计为“0”，强带和弱带均计为“1”为反映RAPD标记的多态性，统计各引物的多态条带百分 率聚类分析采用UPGMA(unweighted pair group mean average)进行 ' ,菌株间的遗传相似度 以连锁距离(linkage distance)表示,建立树状图2结果与分析2. 1 ITS-PCR的扩增结果青枯雷尔氏菌ITS-PCR扩增结果见图1,从图中可以看出引物Pf/Pr成功地扩增了 17个供试菌株中的8个青枯雷尔氏菌的rDNA 16s~23s区段，各个菌株的分了量大小相同，约为620bpoM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 CK图1：青枯宙尔氏M 1TS-PCR扩増结果电泳图注：图中编号与表1相同；M：为DNA标记CK：为水做为空白对照Fig. 1 ITS-PCR amplified of R-solanacearum2. 2青枯雷尔氏菌ITS序列分析将成功扩增出的8个菌株PCR产物纯化后，进行PCR产物育接测序（由大连宝生物•工程有 限公司完成测序工作）,将获得的序列与参比菌株GM11000 1TS1区序列（由Genbank ±获取） 进行比对，结果显示这8条序列基木相同，只有一、两个碱基差异，和GMI1000菌株只有1个 碱基的差异。

8080160160■<•1： _ •...... ■.._ 二-.亠护垃 颐磴400400GMI1000.ITS1Sample.ITSlAUGGE 二 GTGATTGTATCAACC免 GTATTACGAGTGATCGAAAGACCGCTTGGAATACjGCACAA actgggttgtgattgtatcaaccagtattacgagtgatcgaaagaccgcttggaatac|。