微生物限度检查方法适用性试验专项方案模板药典.doc

验证文件类 别： 编 号：部 门：XXXX微生物程度检验方法适用性试验方案XXXXX企业XXXX微生物程度检验方法适用性试验方案审批起草起草部门签 名日 期质量管理部年 月 日审核审核部门签 名日 期质量管理部年 月 日同意同意人签 名日 期 年 月 日目 录1、 适用范围2、 目标3、概述4、适用性所需要仪器设备及文件5、可接收程度范围标准6、测试方法7、异常情况处理8、测试结果9、结论10、再适用性周期11、附表1、适用范围本适用性方案适适用于XXXX微生物程度检验方法适用性试验2、目标因《中国药典》（）颁布实施，为确保该产品微生物程度检验方法可靠性和可操作性，故对其检验方法进行适用性试验，以符合《中国药典》要求3、概述3.1依据《中国药典》 四部通则1105非无菌产品微生物程度检验：微生物计数法、1106非无菌产品微生物程度检验：控制菌检验法，对XXXX进行需氧菌、霉菌和酵母菌、大肠埃希菌检验方法适用性试验，以确定供试品抑菌活性及测定方法可靠性3.2适用性试验时间及批号： 年 月 日开始分别对 、 、 三批XXXX进行独立方法适用性试验。

3.3验证小组部门姓名职务职责4、仪器设备及文件4.1需用仪器设备 器具名称规格型号仪器编号检定日期检定单位使用期4.2文件及存放地方资料名称存放地点5、可接收程度范围标准5.1XXXX微生物程度检验质量标准项目标准要求需氧菌总数霉菌和酵母菌总数控制菌不得检出大肠埃希菌（1g）5.2需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法采取《中国药典》四部通则1105非无菌产品微生物程度检验：微生物计数法中叙述平皿法中倾注法控制菌检验方法采取1106非无菌产品微生物程度检验：控制菌检验法中大肠埃希菌检验方法6、测试方法6.1供试品 XXXX 批号： 6.2培养基及菌种6.2.1采取符合中国药典要求干燥培养基，并经过培养基适用性检验胰酪大豆胨琼脂培养基 批号： 胰酪大豆胨液体培养基 批号：沙氏葡萄糖琼脂培养基 批号： 沙氏葡萄糖液体培养基 批号：麦康凯琼脂培养基 批号： 麦康凯液体培养基 批号： MUG培养基 批号： 6.2.2菌种均购于：菌种名称编号购入日期传代日期传代次数枯草芽孢杆菌第 代金黄色葡萄球菌第 代铜绿假单胞菌第 代大肠埃希菌第 代白色念珠菌第 代黑曲霉第 代6.3菌液制备6.3.1需氧菌、霉菌和酵母菌检验菌液制备6.3.1.1接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌适量至胰酪大豆胨液体培养基中， 30～35℃培养18～二十四小时，取上述培养物一定量用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成制成适宜浓度菌悬液，备用。

6.3.1.2接种白色念珠菌适量至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天，取上述培养物一定量用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度菌悬液，备用6.3.1.3接种黑曲霉适量至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天，加入3～5ml含 0.05％（ml/ml）聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱然后，采取适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05％（ml/ml）聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度黑曲霉孢子悬液，备用菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保留在2～8℃可在二十四小时内使用黑曲霉孢子悬液可保留在2～8℃，在适用性过程贮存期内使用6.3.2控制菌检验菌液制备接种大肠埃希菌适量至胰酪大豆胨液体培养基中， 30～35℃培养18～二十四小时，取上述培养物用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成制成适宜浓度菌悬液，备用菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保留在2～8℃可在二十四小时内使用菌落数确定稀释等级104稀释等级105稀释等级106稀释等级107枯草芽孢杆菌（cfu/ml）金黄色葡萄球菌（cfu/ml）铜绿假单胞菌（cfu/ml）大肠埃希菌（cfu/ml）白色念珠菌（cfu/ml）黑曲霉（cfu/ml）6.4需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数计数方法适用性试验6.4.1供试液制备取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10供试液。

6.4.2试验步骤6.4.2.1试验组 分别取5份1：10供试液各10ml分别加入0.1ml试验菌液（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉）混匀，使每1ml供试液中含菌量小于100cfu取1ml含试验菌液供试液分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿另取1ml含白色念珠菌和黑曲霉供试液分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿按平皿法测定其菌落数，胰酪大豆胨琼脂培养基用于需氧菌总数计数，沙氏葡萄糖琼脂培养基用于霉菌、酵母菌总数计数6.4.2.2供试品对照组 取制备好供试液，以稀释液替换菌液同试验组操作6.4.2.3菌液组 取不含中和剂及灭活剂对应稀释液替换供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验6.4.2.4阴性对照 取对应稀释液替换供试液和菌液同试验组操作6.4.3培养和计数： 胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30～35℃培养3～5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5天，观察菌落生长情况，点计平板上生长全部菌落数，计数并汇报菌落蔓延生长成片平板不宜计数点计菌落数后，计算各稀释级供试液平均菌落数，按菌数汇报规则汇报菌数。

若同稀释等级两个平板菌落平均数大于15，则两个平板菌落数不能相差1倍或以上6.4.4计算公式6.4.5结果判定试验组菌落数减去供试品对照组菌落数值和菌液对照组菌落数比值应在0.5～2范围内，可用所用供试液制备方法及计数方法进行该供试品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数若还存在一株或多株试验菌回收达不到要求，那么选择回收最靠近要求方法和试验条件进行供试品检査6.5控制菌 大肠埃希菌6.5.1供试液制备取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10供试液6.5.2试验分组6.5.2.1试验组 取制备好1:10供试液10ml，加入0.1ml含菌数50～100cfu大肠埃希菌菌悬液，置100ml灭菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置30～35℃培养18～24h6.5.2.2供试品组取制备好1:10供试液10ml，置100ml灭菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置30～35℃培养18～24h6.5.2.3阴性对照组取制备好PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，置100ml灭菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置30～35℃培养18～24h6.5.2.4阳性对照组取稀释液10ml替换供试液，加入0.1ml 50～100cfu大肠埃希菌菌悬液，置100ml灭菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置30～35℃培养18～24h。

6.5.3取上述培养物1ml，接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜判定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但判定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌大肠埃希菌判定应显MUG和靛基质阳性6.5.4结果判定若试验组检出试验菌，可按此供试液制备法和控制菌检验法进行供试品该控制菌检验；若试验组未检出试验菌，应采取其它方法消除供试品抑菌活性，并重新进行方法适用性试验7、异常情况处理严格根据微生物程度检验法操作，如在检测中出现不符合要求情况出现，分析问题原因后，决定是否需对本方案中设定XXXX微生物程度检验方法进行修改，并重新进行方法适用性试验8测试结果8.1需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验结果见附表1至38.2大肠埃希菌检验方法适用性试验结果见附表4-69结论10再适用性周期10.1XXXX因其它原因变更造成XXXX物料性质改变时，需要对本方案进行调整后作方法学再适用性试验10.2国家相关微生物程度检验标准修改后需要对本方法重新进行方法再适用性试验。