表(二)任务书(阳启顺).doc

昆昆 明明 学学 院院2014 届毕业论文（设计）任务书届毕业论文（设计）任务书论文（设计）题目论文（设计）题目光照对拟南芥抗灰霉菌分泌毒素的影响 子课题题目子课题题目 论文（设计）期限论文（设计）期限2014 年 02 月 25 日 至 05 月 17 日（共 12 周）姓姓 名名 阳启顺 学学 号号 201014010220 所属院系所属院系 生命科学与技术系 专业班级专业班级 10 级生物科学 2 班 指导教师指导教师 杨红玉 教授 教务处编教务处编论文（设计）课题来源论文（设计）课题类型国家自然科学基金实验研究类本论文（设计）的目的和要求（包括教师应给出的设计原始资料）灰霉菌（Botrytis cinerea）引起世界范围内多种重要经济作物病害，特别是温室及大棚内的高温高湿环境，很适合灰霉菌生长繁殖，因此灰霉菌被认为是对温室花卉、大棚蔬菜和育苗期经济作物危害最大的病原体之一。

灰霉菌在植物贮运中继续繁殖侵染，因此，它不仅造成农作物收成前的经济损失，而且导致收成后的重大经济损失现在已知的灰霉菌蛋白有两种，即对植物生长具有抑制作用的毒素蛋白和对植物生长具有促进作用的激活蛋白 植物病原真菌毒素是病原物产生的次生代谢物，为病原物与植物间互作识别过程中的产物，往往在植物病程发展中起着重要作用激活蛋白能诱导多种植物产生一系列的系统抗性，能促进植物生长，改善作物品质因此，本课题目的在于通过将灰霉菌大分子毒素渗入到拟南芥叶片中，设置光照、黑暗为对照实验，统计病情指数，利用统计学分析结果，进一步探索光照对拟南芥抗灰霉菌分泌毒素的影响，进而为研究灰霉菌的致病机制作出铺垫在做实验之前，必须要把每一个步骤弄清楚，特别是在测定粗蛋白含量时，应详尽各个试剂的量，在避免浪费的同时又注重实验的效率学生应完成的任务（包括设计计算说明书、图纸等）一、制定实验方案1.查阅相关文献资料； 2.配制所需溶液.3.准备所需的实验材料和仪器设备二、实验实施方案1. 拟南芥和灰霉菌的培养（1）拟南芥的培养取适量的拟南芥种子于 1.5ml 的离心管中，加入 1ml 无菌水浸泡 30 分钟，然后分别用 1ml95%酒精和 0.1%HgCl 消毒 5 分钟，无菌水洗涤 5 次。

然后将消毒好的种子均匀散到灭过菌的 MS 培养基上，封口膜封口，标上日期，放到 4 度冰箱春化 2 天将培养皿置于光照培养箱中（12h 光照，22°C）培养直到长出 2 片真叶时将幼苗移栽到装有灭菌腐殖土的小花盆中，花盆放在托盘中，托盘内盛有水，用保鲜膜覆盖小花盆 4 天后揭开保鲜膜温度保持在 22 度左右，光照时间为 12 小时2）灰霉菌的培养将灰霉菌菌种接到马铃薯培养基中 22℃，黑暗，倒置培养 10 天，将马铃薯培养基上生长的灰霉菌接种于装有马铃薯培养液的三角瓶中，用棉塞封口置于 180 转/分振荡恒温培养箱中培养 5 天，温度保持在 25-28℃2. 灰霉菌分泌的大分子毒素的提取将三角瓶中的培养液于 4℃，5000r/min 离心 15 分钟，收集上清液，用布氏漏斗、真空水循环泵和定性滤纸（快、中、慢各一次）抽滤上清液，滤出液-80℃冷冻干燥，然后用无菌水溶解，溶解液在 4℃灭菌水中透析 2 天，其中每 8h 换一次水，截留分子量大于 14,000Da 的大分子物质,透析袋里的即为大分子毒素透析袋里粗蛋白含量仍然很低，进而选择冷冻干燥，将粗蛋白进一步提纯3. 灰霉大分子毒素蛋白含量的鉴定紫外光吸收法：由于多数蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等苯环结构的氨基酸，而这些氨基酸在紫外光 280nm 有最大吸收高峰，吸收值与蛋白质的含量成正比，所以采用 280nm 紫外吸收法测定蛋白质含量。

样品蛋白含量测定：取样品适量，在 280nm 下以蒸馏水为对照测定其吸光度值，然后根据已制作完成的标准曲线，计算出粗毒素中蛋白质含量Bradford 法：G-250 (Coomassie birlliant blue, G-250)有红、蓝两种不同颜色的形式在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定反应化合物在465～595nm 处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比首先用牛血清蛋白在 595nm 下制作标准曲线，再在 280nm 下测出粗蛋白吸光度值，根据标准曲线计算出粗蛋白浓度4. 将已知浓度的粗蛋白配制成 200μg/ml、500μg/ml，每片叶子渗入 10l观察、记录病情指数，并进行统计学分析设置对照实验，分组如下表：三、进行实验结果分析四、按照昆明学院毕业论文要求，撰写和修改毕业论文五、毕业论文答辩条件渗入粗毒素（叶片数）渗入蒸馏水（叶片数）渗入牛血清蛋白（叶片数）光照2055黑暗2055论文（设计）各部分内容和时间分配（可根据具体时间安排添加）第 1 ~ 1 周：查阅相关文献，撰写开题报告第 2 ~ 8 周：进行实验，获得实验结果并分析结果第 9 ~ 10 周：毕业论文的撰写、修改和定稿第 11 ~ 11 周：毕业论文答辩参考文献（教师指定学生阅读的参考文献，不少于 5 篇）[1] 曹仪植.拟南芥[M].高等教育出版社,2004.[2] 陈璋. 拟南芥:植物分子生物学研究的模式物种.植物学通报.1994,11(1)：6-11.[3]孟金陵. 拟南芥及其分子生物学的研究.遗传,1995,17(增刊):41-45.[4] 张振桢, 许煜泉, 黄海. 拟南芥一把打开植物生命奥秘大门的钥匙[J]. 生命科学, 2006, 18(5): 442-446.[5] 中国科学院植物研究所. 中国高等植物图鉴(第二册). 北京: 科学出版社, 1972[6] 安贤惠. 拟南芥及其研究进展. 西北农林学报. 1998, 7（1）: 92-94. [7] 樊妙姬拟南芥的分子遗传学研究概况遗传. 1992, 14(3): 40-4[7] 樊妙姬拟南芥的分子遗传学研究概况遗传. 1992, 14(3): 40-4[8] 杨红玉,李湘,张一凡等.灰霉菌培养及其对拟南芥的侵染[J].西南农业学报,2005,18(4): 431-434.[9] 朱宝成,梁伯,周毓君等.草莓灰霉病菌的培养、毒素提取及生物测定[J].植物病理学报,1994, [10] 郑晓莲,董金皋,齐秋锁等.灰葡萄孢毒素的组分分析和生物测定[J].植物病理学报,1998,28(3): 269-274.任务下达日期2013 年 1 月 23 日学生应送交毕业 论文（设计）日 期2013 年 5 月 17 日指导教师签字年 月 日接受任务学生 签 字年 月 日教研室主任 审核签字： 年 月 日院系领导审定 签字： 院系盖章： 年 月 日注：注：1．此任务书由指导教师填写，各系审定，下达任务的期限为：本科第七学期，三年制专科第五学期，五年制专科第九学期； 2．课题来源分为：校外课题、学校科研或质量工程立项课题（含国家、省、市、校级立项） 、院（系）内拟定课题、学生自拟课题等； 3．课题类型分为：工程设计类、理论研究类、实验研究类、计算机软件设计类、综合应用类等。