生化大实验实验报告.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑生化大实验实验报告 一 蛋白质提取、纯化及分析技术 测验一 多酚氧化酶（PPO）的分开提取 一、材料与试剂 （1）马铃薯（大约每小组200-300g） （2）试剂： 0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02m巯基乙醇，0.001m EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02m巯基乙醇，0.001m EDTA，0.005m MgCL2）配置时配 （3）测验器械与仪器设备： 试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；PH计和PH试纸；GL-20C高速冷冻离心机； DL-7A大容量低速冷冻离心机 二、操作步骤 1：粗酶提取： 马铃薯组织按1：1（W/V）比例与0.03m磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001m EDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液 2：盐析分级沉淀： 在酶提取液中参与固体硫酸铵使其达成40%饱和度（边加边搅拌达成充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在参与固体硫酸铵达成70%饱和度（边加边搅拌达成充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。

沉淀用0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCL2）溶解，装入透析袋中用0.02N KCL溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用 三、测验结果 获得PPO粗酶液供上柱使用 测验二 柱层析纯化PPO 一、材料与试剂 试剂：0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001M EDTA)配制时配10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇；葡聚糖凝胶Sephadex G-200等； 测验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机 二、操作步骤 1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡 （1）柱材处理 称取确定量的Sephadex G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细 微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前确定要将凝胶液中的气体除掉，其手段是将凝胶液放进抽滤瓶中，举行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡展现为止。

（2）装柱 将层析柱清洗明净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，开启下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适合浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分开速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分开效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然逐渐沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处，中断装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片笼罩于凝胶上层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡 （3）平衡 在柱层析上样前务必对层析柱举行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，开启层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达成了平衡在本测验中，用0.002M Tris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，平衡Sephadex G-200凝胶 2．上样：将粗酶液上柱 3．洗脱：用0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4（内含0.001M EDTA）洗脱，收集洗脱液举行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的根本性质分析测定。

4．测定酶活性和蛋白质浓度 解释：透析就是把（NH4）2SO4透析出去 三、测验结果 取含有蛋白的洗脱液第1至19管，每管含洗脱液约5ml，以供后续测验检测蛋白含量和酶活用 测验三 测验蛋白质含量及活性测定 一、仪器与试剂 1．材料： 经硫酸铵沉淀获得PPO粗酶液， Sephadex G-200分开纯化的酶液样品 2．仪器与器皿： 分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管和试管等 3．试剂： 考马斯亮蓝G-100蛋白试剂： 称取100mg考马斯亮蓝G-100溶于50ml90％的乙醇中，参与85％（V/V）磷酸100ml，结果参与无离子水或蒸馏水定容到1000ml，此溶液可在常温下放置一个月 二、操作步骤 样品中蛋白质浓度的测定： 蛋白质含量测定（630nm）96孔酶标板依次参与考马斯亮兰100微升，样品10微升，原酶液10微升，对照为Tris-HCl缓冲液10微升用DG5031型酶联免疫检测仪测定蛋白质含量 样品中PPO活性的测定： 96孔酶标板依次参与磷酸-柠檬酸缓冲液100μL→底物邻苯二酚10μL→样品10μL， 原酶液10μL，对照为Tris-HCl缓冲液10μL。

三、测验结果 结果列表 表1 葡萄糖凝胶处理过柱后酶活与蛋白质含量（OD值） 图1 PPO蛋白含量和活性OD值 从图表中可以看出，其中5和6号试管中PPO的含量较高，5号试管的活性最高，说明5号试管中的PPO纯化度最高 测验四 SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定 一、仪器与试剂 1．材料： 硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品，Sephadex G-100柱层析的样品 2．试剂： （1）丙稀酰胺(Acr母液)：30％Acr （Acr/Bis） （2）10％的SDS溶液 （3）10％的过硫酸铵溶液 （4）四甲基乙二胺（TEMED） （5）分开胶缓冲液：1.5M Tris,PH8.8 （6）浓缩胶缓冲液：1.0M Tris,PH6.8 （7）电极缓冲液：1030g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml,pH8.3 （8）样品缓冲液：0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰 （9）染色液：0.15％考马斯亮蓝R250，溶于脱色液 （10）脱色液：50％的甲醇，7％的冰醋酸的水溶液 （11）标准分子量蛋白。

3．仪器设备： 电泳仪，垂直电泳槽等 二、操作步骤 1.凝胶制备： 用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置将配制好的分开胶溶液，倒入，滴参与无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子 分开胶和浓缩胶的配备分别是： 30%的胶母液 12.5ML 胶母液 2.5ML PH8.8Tris缓冲液 10ML PH8.8Tris缓冲液 2.5ML 水 7.4ML 水 14.5ML SDS 800Ul SDS 400Ul AP 150uL AP 150uL TEMED 25uL TEMED 25uL 2.上样：分别取样品若干ml于离心管中，按1/1-1/5比例参与5样品缓冲液，再沸水浴中加热3－5min，取出待用。

用微量注射器分别吸取不超过30ul不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽点样终止后，调理电泳仪电流到10mA（2－3mA/em），保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分开胶底1－2cm时，即可中断电泳 3．染色：电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温过夜倒掉染色液，24h后，即可看到明显的蛋白质条带 4．标准蛋白质迁移率－分子量对数图制作及未知蛋白质分子量计算 三、测验结果 电泳槽中溴酚兰指示条带展现明显的条带；整个泳道染色偏重，可能是原液中含好多杂质所致；2柱的染色结果很淡，可能是酶蛋白含量偏低造成从测验结果可以看出，随着纯化的举行，条带颜色越来越浅，杂带得颜色也越来浅（纯化的样品的条带明显比杂带的明显），说明杂蛋白的含量裁减，但酶蛋白含量也大量的裁减Maker处境不领会，无法判断分子量 测验五 胰酶分开提取 一、材料与试剂 1．仪器 紫外光分光光度计、恒温水浴、离心机、组织捣碎机、PH计、显微镜、秒表、剪刀、镊子、搪瓷盆、乳钵、大玻璃漏斗、抽滤瓶，塑料小桶、纱布、PH试纸，滤纸、玻璃器皿等 2．材料：崭新猪胰脏 3．试剂及溶液配制 pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL溶液、0.01M HCL溶液、0.4M pH9.0硼酸缓冲液（母液为0.8M，用时稀释一倍）、Tris、 硫酸铵。

0.8M pH9.0硼酸缓冲液：取20ml0.8M四硼酸钠溶液，混合后用PH计校正 二、操作步骤 （1）崭新猪胰脏一个，剥除脂肪和结缔组织→称重27.5g→手动绞肉机绞碎→参与2倍体积预冷的pH2.5-3.0乙酸酸化水溶液60ml提取→用10%乙酸调理pH在3.0以下→冷室5℃提取20h 胰蛋白酶提取关键：操纵低温；操纵pH低于3.0，维持胰蛋白酶提取过程中的稳定 操作过程中的问题：乙酸调理酸度不稳定 （2）过夜后粗提取物四层纱布过滤，滤液呈乳白色→滤渣再参与10ml乙酸溶液浸提残渣，浸提2h （3）浸提液离心，取上层黄绿色清液110ml，称量52.36g硫酸铵盐（每100ml参与47.36g）缓慢参与溶解→冷室静置 （4）冷置后离心10min得胰蛋白酶粗制品→取沉淀称重10g→计算需要参与氯化钙的质量[m1/41/132111g/M + （0.1M1010g/1000）111g/M = m钙]，计算后需要参与氯化钙3.2g混匀 →用氢氧化钠溶液调理pH至8.0，过夜 （5）75%硫酸铵溶液沉淀，包括猪胰酶沉淀和硫酸钙沉淀，为俭约时间，此步骤老师已经打定好离心10000g 10min ,沉淀转移到50ml离心管，加15ml蒸馏水复溶，再10000g离心，得上层清液预备上柱。

测验六 卵清蛋白分开提取 一、材料与试剂： 1．材料：崭新鸡蛋2只 2：仪器：抽滤瓶500－1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器 3：试剂： 10％TCA，用固体NaOH调调PH至1.05－1.10，需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M，PH8.0Tris-HCL缓冲液（每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2），50ml pH8.0,0.1M Tris-HCL缓冲液 二、操作步骤 （1）崭新鸡蛋两。