发酵工程2(菌种选育)PPT课件.ppt

第一章 微生物菌种选育v菌种选育：利用微生物的遗传变异的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传性状自然选育：根据菌种自然变异的特点进行选育的过程人工选育：人为方式改变微生物菌株遗传物质选育过程，包括诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程育种等高新技术第一节 菌种的来源 一、工业发酵常见微生物种类v细菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌乳酸杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌最常用的工业微生物v酵母菌酿酒酵母假丝酵母属v产朊假丝酵母v解脂假丝酵母v热带假丝酵母毕赤酵母属、汉逊酵母属最常用的工业微生物v霉菌曲霉属v米曲霉v黑曲霉青霉属v青霉菌：点青霉、产黄青霉v桔青霉根霉属v德氏根霉v米根霉、小麦曲根霉红曲霉属v紫红曲霉最常用的工业微生物v放线菌链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌v担子菌菇类多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发v藻类自养微生物人类的保健食品和饲料v担子菌菇类多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发v藻类自养微生物人类的保健食品和饲料v担子菌菇类多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发v藻类自养微生物人类的保健食品和饲料二、工业微生物的来源v根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；v从大自然中分离筛选新的微生物菌种。

v从一些发酵制品中分离目的菌，如从酱油中分离蛋白酶产生菌；从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶产生菌三、微生物菌种的选择性分离v菌株分离就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，进而得到所需微生物的过程v工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需菌株；二是把分离的菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别v菌株的分离和筛选：采样、富集、目的菌筛选等 1.采样v以采集土壤为主一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内v纤维素酶产生菌选择枯枝落叶富含纤维素的森林土；v淀粉酶产生菌选择面粉厂、酒厂、糕点厂等场所的土壤；v蛋白酶和脂肪酶产生菌可选择肉类加工厂附近污泥等从自然界筛选v采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好v采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离2.富集培养v富集培养可增加待分离菌的数量，增加分离的成功率。

v为了容易分离到所需的菌种，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制v例如碳源利用的控制，可选定糖、淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多v为提高分离的效率, 常以投其所好和取其所抗的原则在培养基中添加特殊的养分或抗菌物质, 使所需菌种的数量相对增加, 这种方法称为增殖培养或富集培养, 其实质是使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌, 便于将它们从样品中分离 v例如分离放线菌时，在土壤样品悬液中加入数滴10的酚，可抑制霉菌和细菌的生长 富集的主要方案：q 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养控制营养和培养条件增加目的微生物数量，也可高温高压、加入抗生素等减少非目的微生物的数量目的微生物富集的一些基本方法 富集的目的：q 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能定向培养的富集方法 1.底物 2.pH条件 3.培养时间 4.培养温度 等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批、连续）后使目的微生物在种群中占优势菌落的选出 q 从产物角度出发 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素 q 从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。

如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选采样（造纸 厂）80、30min处理文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5、培养34天，选择有凹陷圈的菌落从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型 3.培养分离v尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态因此还必须分离，纯化，在固体培养基平板上获得单菌落v纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法v分离的效率取决于培养基养分、pH、温度和加入的选择性抑制剂v嗜中性放线菌分离培养基pH常在6.77.5，嗜酸性放线菌pH降至4.55.0v放线菌筛选时，可加入真菌抗生素，对放线菌无作用v分离放线菌分离平板通常在2530培养嗜热菌4555 ，嗜冷菌410 4.筛 选v平板上单菌落，通过菌落形态观察，进行菌落鉴定，符合要求，转移到试管斜面进行纯培养v采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种5.毒性试验v自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。

v据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验第二节 菌种的选育一、菌种选育意义：发酵产品的种类、产量和质量有较大的改善二、菌种选育的定义： 根据微生物遗传物质极易发生变异特性，用人工方法造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程三、常用菌种的选育方法： 1）自然选育； 2）诱变育种； 3）杂交育种； 4）分子育种四、自然选育1.自然选育 在生产过程中，不经人工处理，利用菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程但突变的频率较低2.自然突变的两种可能 菌种衰退，生产能力下降； 代谢更加旺盛，生产性能提高3.自然选育的方法单菌落纯种分离五、诱变育种（Mutation breeding） 1.诱变育种的含义 应用微生物遗传和变异理论，用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群, 促进其突变率大幅度提高, 然后采用简便、快速和高效的筛选方法, 从中挑选少数符合育种目的的突变株, 以供生产实践或科学研究用 v诱变育种具有方法简单、快速和收效显著等特点，仍是目前被广泛使用的主要育种手段 v当前发酵工业中使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株。

诱变育种除能提高产量外, 还可达到改善产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的2.诱变育种的一般步骤1）出发菌株的选择2）单细胞（或单孢子）悬液制备3）诱变剂和使用剂量的选择4）变异株的初筛5）变异株的复筛6）变异株稳定性试验7）菌种特性考察8）中试验证9）大型投产试验1）出发菌株的选择 用来育种处理的起始菌株称为出发菌株 出发菌株的来源主要有以下三方面： 自然界直接分离到的野生型菌株 这些菌株的特点是它们的酶系统完整, 染色体或DNA未损伤，但它们的生产性能通常很差(这正是它们能在大自然中生存的原因), 通过诱变育种, 它们正突变(即产量或质量性状向好的方向改变)的可能性大 经历过生产条件考验的菌株 这些菌株已有一定的生产性状, 对生产环境有较好的适应性, 正突变的可能性也很大 经历多次育种处理的菌株 这些菌株的染色体已有较大的损伤,某些生理功能或酶系统有缺损, 产量性状已经达到了一定水平，它们负突变(即产量或质量性状向差的方向改变)的可能性很大，可以正突变的位点已经被利用了，继续诱变处理很可能导致产量下降甚至死亡 因此，在实际生产中，一般可选择或类菌株, 尤以第类最佳, 因为它可以向好的方向发展。

在抗生素生产菌育种中，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有所提高的菌株作出发菌株，在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，最好考虑至少能积累少量产品或其前体的菌株2）单细胞（或单孢子）悬液制备 诱变处理的菌株应考虑微生物的生理状态、菌株的均一性和环境条件 适合用于诱变育种的微生物生理状态： 一般要求细菌和酵母菌体处于对数生长期, 并采取一定的措施促使细胞处于同步生长 对产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢，因此，霉菌和放线菌应处于单细胞状态，即形成孢子的时期，对孢子进行诱变为什么霉菌和放线菌用孢子进行诱变处理？1.能使分散状态细胞均匀地接触诱变剂；2.它尽可能地避免出现表型延迟现象 表型延迟(Phenotypic lag)是指某一突变在 DNA复制和细胞分裂后, 才在细胞表型上显示出来, 造成不纯的菌落的现象出现这种现象的原因是诱变对象处于多核时期造成的 霉菌和放线菌对数期细胞往往是多核的, 很可能一个核发生突变, 而另一个核未突变, 若突变性状是隐性的, 在当代并不表现出来, 在筛选时就会被淘汰; 若突变性状是显性的, 那么, 在当代就表现出来, 但在进一步传代后, 就会出现分离现象, 造成生产性状衰退, 因此，应尽可能选择孢子或单倍体的细胞作为诱变对象。

即使如此, 有时也会出现表型延迟现象, 这是因为诱变剂往往只作用于DNA分子的一条单链，DNA 进一步复制后, 同样会出现不纯的菌落这类表型延迟称为分离性延迟现象 菌株的均一性 菌悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞 机会均等并充分地接触，避免细胞团中变异菌 株与非变异菌株混杂，出现不纯的菌落，给后 续的筛选工作造成困难 为避免细胞团出现, 可用玻璃珠振荡打散 细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤, 得到分散 的菌体 菌悬液的细胞浓度一般控制为: 真菌孢子或酵母细胞 106107 个/ml； 放线菌或细菌 108个/ml 菌悬液一般用生理盐水(0.85% NaCl)稀释 有时用化学诱变剂处理时，需要0.1mol/L 磷酸缓冲液稀释, 因为有些化学诱变剂处理时, 常常会改变反应液的pH值3）菌种诱变剂和使用剂量的选择 诱变剂的含义： 凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素， 统称为诱变因素或诱变剂 分类： 物理诱变，如紫外线、-射线、X-射线、 快中子、激光、等离子体、高压等 化学诱变，如硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝酸、碱基类、吖啶类物质等 诱变剂量的选择： 一般来说，诱变率随诱变剂量的增高而提高，因此，通常诱变剂量采用致死率90%99%的剂量，但是，对于经过一再诱变的高产菌，诱变剂量要低得多（致死率在90%99%）。

诱变处理的方法： 单一处理：一次用一种的诱变剂处理方法处理菌种 复合处理：两种以上的诱变处理方法处理菌种，这种处理方法通常较单一处理的效果好诱变剂复合处理及协同效应 单独处理 复合处理菌种 诱变剂 突变率 诱变剂 突变率土曲霉 紫外线 21.7 紫外线 + X射线 42.8 X射线 19.7黑曲霉 氮芥0.1 不明显 氮芥 + 紫外线 11.0 紫外线 4.7链霉菌 二乙烯三胺 6.06 二乙烯三胺 + 紫外线 26.6 硫酸二乙酯 1.78 硫酸二乙酯 + 紫外线 35.86 紫外线 12.5某些化学诱变剂常用浓度及处理时间诱变剂 浓度 处理时间(min) 中止方法二乙酯 0.11% 1824 硫代硫酸钠或稀释亚硝基胍 0.13/ml 60120 大量稀释4）突变株的筛选 菌体细胞经诱变剂处理后, 要从大量的变异菌株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来, 这需要有明确的筛选目标和筛选方法, 需要进行认真细致的筛选工作 育种工作中常采用随机筛选和理性化筛选这两种筛选方法随机筛选： 菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，在随机挑选单菌落中筛选出高产菌株该方法工作量极大为了提高筛选效率, 可采用下列方法增大筛选量。

（1）摇瓶筛选法； （2）琼脂块筛选法； （3）筛选自动化； （4）筛选工具微型化 （1）摇瓶筛选法 这是生产上一直使用的传统方法 将挑出的单菌落传种到斜面后, 由斜面接入模拟发酵工艺的摇瓶中培养, 然后测定其发酵生产能力。