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新生鼠海马、皮层神经元原代培养.doc

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  • 卖家[上传人]:gg****m
  • 文档编号:204063330
  • 上传时间:2021-10-24
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    • 新生鼠海马、皮层神经元原代培养实验材料1. 实验动物新生Wistar大鼠,当天出生(<12h)的乳鼠,SPF级2. 试剂Hibernate ANeurobasal AB27 serum-free supplementsPapin (木瓜蛋白酶)DNAase IOptiPrep Density Gradient MediumPoly-L-lysine (多聚赖氨酸)L-glutamine (L ■谷氨酰胺)Penicillin (青霉素)Streptomycin (链霉素)D-Hanks solutiondd H203. 溶液配制1. 多聚赖氨酸:取多聚赖氨酸25 mg,用双蒸水溶解并稀释浓度为50Ug/ml,用0.2 Um的微孔滤膜过滤,4 C保存备用可配成25 X )2. 解剖液:HA:含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A, 0.22 u m微孔 滤膜过滤,4 C保存备用3. Papin:用 HA 配制含 Papin 2mg/mL 的消化液,37 C 孵育 20~30min,0.22 um微孔滤膜过滤,冰上保存至实验在使用前3h内配制4. DNAase I:取 DNAase I 粉末用 D>Hank, s 液配制成 50u g/mL, 0.22□ m微孔滤膜过滤。

      可一次配好,・20C保存,每次取用4. 终止消化液:HABG:含2%B27的HA现用现配,37 C保存备 用5. Optiprep 离心介质:Optiprep medium : HABG 为 124 : 876,每离 心管5. 种植液和培养液:Neurobasal-A/B27:含2% B27, 0.5mM L-谷氨酰 胺的Neurobasal-A现用现配,37c C保存备用4. 实验方法1. 包被培养皿使用前2d,在无菌条件下取6孔培养板,加多聚赖氨酸ImL/孔,放 置2h,吸去多余多聚赖氨酸,口然干燥,灭菌水洗板2次,干燥备用2. 组织剥离取出生12 h以内的Wistar人鼠,用75%乙醇擦拭全身消毒无菌条件 下断头,沿正中剪开皮肤和颅骨,向两边分开,小心取出全脑,浸于冰浴 的解剖液首先切除小脑和脑干部分,然后沿正中切为左右两半球,海马 位于半球的腹内侧分别在解剖显微镜下剥离出海马并置于冰浴的解剖液 中,完整的海马(半侧)呈月牙形用精细银小心除去中脑、纹状体等 非皮层结构,剥离出皮层3. 消化和分散用精细剪将海马剪成「2 mm3的组织块,在6 cm培养1111中用配好的 木瓜蛋白酶在37 C下消化30 min, 4个半皮层或16个半海马/10mL消 化液,并加入500 U L DNAase I。

      消化结束后小心吸去消化液,加入2~3mL HABG, 200 M L DNAase I,用ImL移液枪吹打细胞(慢吸快吹)10次,静置2 min,小心吸取上 部细胞悬液,再加入2 mLHABG,200 U L DNAase I,吹打10次,静置2 min, 小心吸取上部细胞悬液,必要可再重复一次将细胞悬液过400目细胞筛 网,然后小心加至离心介质上,每管约6mLo 1900 rpm离心15 min离 心后细胞留在介质和终止液交接部,血细胞被离至管底吸掉上部终止液 后,小心吸取细胞至另一离心管,加入8-10mLNeurobasal A/B27将细胞 重悬,1100 rpm离心5 min,弃上清,加入2 mL Neurobasal A/B27将细胞 重悬,此时若有无法吹散的絮状物弃掉,或将离心管静置片刻,待其沉淀 后吸取上边细胞悬液至另一离心管,加入8^10 mL Neurobasal A/B27将细 胞重悬,1100 rpm 离心 5 min,弃上清,加入 2^3 mL Neurobasal A/B27 重 悬4. 计数和接种取少量细胞悬液以苔盼蓝染液观察存活率并计数o 1X 106/孔的密度接 种在多聚赖氨酸包被的6孔板中,置于37 C, 5%CO2培养箱。

      5. 洗板和换液细胞种下6小时后应贴壁良好,十字摇板10^15次,吸出种植液,用37 C预热的D-Hank, s液洗板3次,每次摇板10^15次镜检碎片基木 洗净后,每孔加入2mL含双抗、谷氨酰胺的Neurobasal A/B27置于37 C, 5%CO2培养箱以后每3天换半液5. 神经元的形态学观察分散培养的大鼠海马神经元,在接种lh后即可贴壁,细胞呈单个圆 形或椭圆形2-3 d后细胞明显增大,突起长出并延伸6~7d时神经元在 相差显微镜下可见具有明显的光晕此时神经元呈三角形或多边形,边界 清晰,胞体明亮,胞核和核仁清晰可见在培养过程中神经元Z间的纤维联系逐渐丰富, 并形成网络随着培养时间的延长,海马神经元逐渐退化变性,表现为神 经元胞体光晕消失,胞体皱缩,突起萎缩,有的出现空泡,直至脱落,造 成神经元的数量逐渐减少注意事项:分离组织要迅速,尽量减少操作时间因用0ptiprep介质离心时 可分离血细胞,分离组织时可不必过细的剔除血点2.3.用于分离组织的液体不能偏碱,会明显影响细胞状态消化后 的组织会释放DNA,导致组织粘稠无法吹开,DNAase可以有效缓解此现象,若发现在上述DNAase量下仍有粘稠,可适当增加 DNAase量。

      粘稠的物质在过筛时无法筛掉,种板后会很快黏至板底,洗 板时无法洗掉,其周围很大面积内没有细胞,严重影响实验成败4.5.种板时细胞密度至少在1X 106/孔(6孔板),过稀细胞无法生长 细胞贴壁6小时后及时洗板,时间长后碎片不易洗掉,影响细胞生长。

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