手足口病标本采集及检测技术方案.doc

附件1 手足口病标本采集及检测技术方案一、采集标本的种类、保存和运输（一）粪便标本采集病人发病3日内的粪便标本，用于病原检测粪便标本采集量5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，4℃暂存12小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱二）咽拭子标本采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签4℃暂存并在12小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱三）血清标本各省（区、市）在手足口病流行年份中均应采集EV71 和CVA16感染的手足口病患儿的双份血清采集急性期（发病0-7d）和恢复期（发病14-30d）双份配对血清用于阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。

静脉采集3-5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签将血清置于-20℃以下冰箱中冷冻保存四）疱疹液在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱五）肛拭子标本采集病人发病3日内的肛拭子标本，用于病原检测用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放入装有3－5ml保存液（含5%牛血清细胞维持液）的15ml外螺旋的采样管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥六）尸检标本采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。

每种组织应多部位取材，每部位应取2-3份约5-10g的组织，淋巴结2个，分别置于15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签七）脑脊液标本出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0-2.0ml采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱但EV71感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到EV71病原临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，12小时内送达实验室依照《人间传染的病原微生物名录》，肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按B类包装，置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象在送到省、地、市级CDC实验室时，包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时，需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》二、标本采集注意事项在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离到病毒即可诊断该病毒为病因。

用于采集咽拭子的无菌拭子要放在标本保存液中，如含5%牛血清维持液用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测不能立即检测的标本应冷冻保存对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集标本保存液的配置见下表：保存液Eagle`s液(MEM)80.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml胎牛血清5.0ml7.5%NaHCO3溶液3.5ml青、链霉素（各10000U/ml）10ml三、实验室检测操作流程（一）病毒分离1.试剂配置（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表：生长液（GM）维持液（MM）Eagle`s液(MEM)86.5ml92.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml1.0ml胎牛血清10.0ml2.0ml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5ml青、链霉素（各10000U/ml）1.0ml1.0ml（2）粪便标本和肛拭子的处理液完全PBS液中加入P．S溶液，终浓度为青霉素100单位/ml，链霉素为100μg/ ml完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即为完全PBS工作液。

A液：试剂品名加入量NACL8.00gKCL0.20gNa2HPO4(无水)0.91gKH2PO40.12g用600～800ml蒸馏水溶解以上盐类，加蒸馏水补至1000ml，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌，即为不完全PBS工作液（不含钙、镁离子）B液：试剂品名加入量MgCl2.6H2O0.10g溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌C液： 试剂品名加入量CaCl20.10g溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌2．病毒分离细胞系许多细胞系可支持人肠道病毒（如EV71、CVA16）生长对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CVA16等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系：Ø RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞Ø HEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞3．标本的处理（1）粪便标本和肛拭子的处理操作步骤：1）在离心管上标记标本号；2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；3）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；肛拭子为2ml；4）剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于－20℃；5）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min；6）在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min；7）在生物安全柜中将每1份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理1次）；8） 1管粪便悬液冻存于－20℃作为备份，另1管存于4-8℃以备接种。

2）疱疹液标本的处理疱疹液标本通常直接用于RNA提取或病毒分离3）脑脊液标本的处理脑脊液标本通常直接用于病毒分离4）咽拭子标本的处理咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒然后在4℃条件下，10000 rpm离心20min，用上清接种到细胞上或直接提取RNA如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌4．接种和观察（病毒分离）（1）通常使用８ml的斜面试管培养细胞，传细胞时，每管加细胞培养液1.5ml显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康、无污染的一个健康的单层细胞会在传代后48小时左右形成；（2）倒掉生长液（GM），换上1-1.2ml的维持液（MM）；（3）每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）；（4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；（5）每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36℃或者使用吸附的方法接种病毒：接种标本前，倒掉生长液（GM），每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度为36℃；吸附1小时后，换上1.5ml的维持液（MM）。

同样每份标本需同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；（7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE（1+—4+）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1+，<25%; 2+, 25%-50%; 3+, 50%-75%; 4+, 75%-100%）；（8）如果有特征性的肠道病毒CPE出现，要如实记录，并观察直到75%的细胞发生变化（3+ CPE），然后储藏在－20℃以备二次传代；（9）第一代培养见可疑细胞病变时应继续传代，待细胞病变稳定出现后－20℃或－70℃冻存；（10）一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的CPE出现，将病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）因二代病毒滴度高于一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定；（11）如果7d之后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7d注意：同一病例标本的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：不同细胞的培养物应单独传代）；（12）盲传两代后，仍然没有出现CPE的，则判定为阴性；（13）注意：如果接种后24h内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。

取100μl阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐1h后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应；（14）几个概念：A：毒性反应：如果在接种后1-2d内细胞快速凋亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应这些已接种标本的试管应在-20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中（此时是第二代）如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用PBS稀释10倍，再次接种到同种细胞中这时应被认为是第一代 B：微生物污染：由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒造成的CPE无法确定或根本无法出现重新取原始标本，用氯仿或抗生素处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上C：盲传：有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变这时已接种标本的试管应在-20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型的新鲜单层细胞中，再观察7-10d如果盲传两代后仍然没有产生CPE，那么认为这个标本是阴性的5．病毒分离结果解释RD细胞支持HFMD的主要病原体——CVA16和EV71等多种肠道病毒的复制，CVA16和EV71均能在RD细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（CPE），表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落。

但相同滴度的CVA16和EV71在RD细胞中生长的速度不同，EV71的生长速度要快于CVA16，表现为EV71感染RD细胞后出现CPE的时间比CVA16早，EV71接种细胞后出现CPE很快，但CVA16一般要经过2次以上传代才出现明显的CPE若在使用RD细胞分离的同时再增加HEp-2细胞，可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致HFMD的病原体，如一些柯萨奇B组病毒）但CVA16和EV71在HEp-2细胞中均不繁殖二）测定人双份血清标本的中和抗体滴度比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度，可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法，最常用的是中和实验，即用微量板法测定抗体滴度，是目前人肠道病毒抗体检测的最常用方法，该方法精确且具有型特异性作为肠道病毒感染的诊。